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分子實驗方法10:?測序技術

關鍵詞： 分子實驗方法來源：互聯網

第十章測序技術

　　在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于測序的技術主要有Sanger等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam和 Gilbert（1977）發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，產生A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。目前Sanger測序法得到了廣泛的應用。　　Sanger 法測序的原理就是利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

第一節非同位素銀染測序系統操作技術

　　一、概述： 　　Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。銀染提供了一種對于放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成后經90分鐘就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。此外, SILVER SEQUENCETM系統用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物，減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。　　Taq DNA聚合酶在95℃時極強的熱穩定性。本系統利用的測序級Taq DNA聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾產品，對于雙鏈DNA模板有非常好的效果，具有高度的準確性，能產生均一的條帶，且背景低。 SILVER SEQUENCETM系統包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC豐富區域所引起的條帶壓縮現象。　　退火溫度是熱循環測序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結構。提高引物結合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結構則限制了小片斷PCR產物(<500bp)得到清楚的序列數據的能力。引物延伸起始于每個循環的退火階段。在較低溫度時，聚合酶可能會遇到堅固的二級結構區域，它可導致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因，應該使用盡可能高的退火溫度。對于有牢固二級結構的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環模式。一般來說，較長的引物及GC含量高的引物能得到較強的信號。實驗結果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到最佳結果。　　由于本系統采用熱循環裝置, 與常規的測序方法相比具有如下幾點好處：(1).本方法線性擴增模板DNA產生足夠的產物使銀染技術能夠檢測序列條帶，測序反應需要0.03--2pmol模板DNA, 隨模板種類而定。(2). 在每一個變性循環中的高溫可以取代對雙鏈DNA(dsDNA)模板的堿變性及乙醇沉淀過程，變性循環也有助于消除由于線性dsDNA模板(如PCR反應產物)快速重退火所引起的問題。(3). 高溫聚合酶反應減弱了DNA模板的二級結構，允許聚合酶穿過高度二級結構化的區域。　　二、材料 待測已提純的DNA，可為單鏈，也可為雙鏈。　　三、設備 高壓電泳儀，測序用電泳槽，制膠設備，PCR儀。　　四、試劑 　　（1）SILVER SEQUENCETM DNA測序試劑盒。　　（2）丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺儲備液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉雙丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉雙丙烯酰胺溶于140ml 雙蒸水中，定容至250ml，0.45mm過濾器過濾后，貯于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。　　（3）10%過硫酸銨，0.5g過硫酸銨溶于4ml水中，定容至5ml，應新配新用。　　（4）10×TBE緩沖液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ?2H2O，溶于雙蒸水中定容至1升，置于4℃下可貯存2周，其pH約為8.3。　　（5）TBE電極緩沖液：10×TBE 緩沖液稀釋至1×TBE備用。　　（6）TEMED 　　（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升備用。　　（8）染色溶液：硝酸銀2克，甲醛3ml，溶于2升超純水中備用。　　（9）顯影溶液：60克碳酸鈉（Na2CO3)溶于2升超純水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸鈉溶液（10mg/ml)。　　（10）95%乙醇。　　（11）0.5%冰乙酸。　　（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。　　五、操作步驟： 　　成功地使用銀染測序系統需要對提供的操作方法進行仔細考慮。銀染不如放射性檢測法靈敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通過延長X-光膠片曝光時間的方法增加信號強度。因此，請使用推薦的DNA模板量, 每次均使用所提供的對照檢查系統的可靠性，并且注意如下幾點：　　　　（1） DNA的濃度和純度必須經過瓊脂糖凝膠電泳或熒光法測定, 樣品應與已知量DNA一起電泳。　　　　（2）分光光度法對于很多DNA提取物包括質粒小量制備來說，并不能給出一個可信的DNA濃度估計，混雜的染色體DNA、蛋白、RNA、有機物及無機化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常錯誤地高估DNA濃度。　　　　（3） DNA制備過程中用核糖核酸酶處理所產生核糖核苷酸，雖然它們在電泳后DNA樣品的前面，并不能觀察到，但它們仍會有260nm光吸收。　　（一）測序反應： 　　　　　1. 對于每組測序反應，標記四個0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃備用。　　　　2. 對于每組四個測序反應,在一個eppendorf管中混合以下試劑：　　　　（1）樣品反應：　　　　　　質粒模板DNA 2.1pmol 　　　　　　5×測序緩沖液 5ml 　　　　　　引物 4.5pmol 　　　　　　無菌ddH2O 至終體積16ml 　　　　（2）對照反應　　　　pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg)　　 4.0ml 　　　　　　5×測序緩沖液 5ml 　　　　　　pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml 　　　　　　無菌ddH2 O 至終體積 16 ml 　　3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。　　4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。　　5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。　　6. 把反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，以[注意]中循環模式為基準，開始循環程序。對于每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350堿基的長度。　　7. 熱循環程序完成后，在每個小管內加入3μl DNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。　　[注意] 1、測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：

模板種類/長度	模板量
200bp (PCR產物)	16ng(120fmol)
3000-5000bp（超螺旋質粒DNA)	4mg (2pmol)
48000bp(λ,粘粒DNA)	1mg(31fmol)

　　由于超螺旋質粒產生的信號比松馳的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。　　　　2、計算與4.5pmol相當的引物納克數可用以下一般公式：　　　　4.5pmol=1.5ng×n,其中n為引物堿基數　　　　計算與1pmol相當的引物微克數可用以下一般公式：　　　　dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n為模板堿基對數　　　　ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n為模板堿基數　　3、為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物，熱循環儀必須預熱至95℃。溫度變換應越快越好。下面的循環時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。　　　　模式1：適用于引物<24堿基或GC含量<50% 　　95℃ 2分鐘。然后： 95℃ 30秒(變性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分鐘(延伸)。　　　　模式2:適用于≥24堿基或略短的GC含量≥50%的引物。　　95℃ 2分鐘, 然后: 95℃ 30秒(變性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入終止溶液之后樣品可在4℃保存過夜。　　（二）、測序凝膠板的制備　　1、玻璃板的處理： 　　銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導致凝膠染色時背景偏高(棕色)。短玻璃板經粘合溶液處理可將凝膠化學交聯于玻璃板上。這一步對于在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關重要。　　（1）短玻璃板的處理　　A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鮮的粘合溶液。　　B. 用經浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過并已經自然干燥的玻璃板, 整個板面都必須擦拭。　　C. 4-5分鐘后, 用95%乙醇單向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重復三次這一清洗過程, 每次均須換用干凈的紙, 除去多余的粘合溶液。　　[注意] 1. 在95%乙醇單向擦玻璃板時過度用力會帶走過多的粘合硅烷, 使凝膠不能很好地粘附。　　　　　　2. 準備長玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。　　　　　　3、防止粘合溶液沾染在長玻璃板上是很重要的, 否則將導致凝膠撕裂。　　(2)、長玻璃板的處理　　A. 用浸透Sigmacote溶液的棉紙擦拭清洗過的長玻璃板。　　B. 5-10分鐘后用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。　　　　[注意] 1. 用過的凝膠可在水中浸泡后用剃須刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板須用去污劑完全清洗。或者凝膠用10% NaOH浸泡后除去。為防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必須與清洗長玻璃板的工具分開, 如果出現交叉污染, 以后制備的凝膠可能撕裂或變得松馳。　　2、凝膠的制備： 　　（1）玻璃板經粘合硅膠和Sigmacote處理后，即可固定玻璃板。該方法是用0.2mm或0.4mm厚的邊條置于玻璃板左右兩側，將另一塊玻璃板壓于其上。在長玻璃板的一側插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。　　（2）根據所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%-8%的膠濃度可獲得較好的結果。配制過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE緩沖液，再用雙蒸水調終體積至99.2ml，并用0.45mm的濾膜過濾，然后加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應等溶液完全冷卻后，方可加入TEMED和過硫酸銨。一般在膠灌制后4-6分鐘，即開始聚合，如果聚合不好，則應使用高濃度的TEMED和過硫酸銨。

?	凝膠終濃度
?	3	4	5	6	8	12	16	18
尿素(g)	42.0	42.0	42.0	42.0	42.0	42.0	42.0	42.0
Acr&Bis(ml)	7.5	10.0	12.0	14.5	20.0	30.0	40.0	50.0
10×TBE緩沖液(ml)	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0
雙蒸水(ml)	47.5	45.0	43.0	40.5	35.0	25.0	15.0	5.0
10%過硫酸銨(ml)	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.8	0.7	0.7
TEMED(ml)	87	80	80	80	80	70	47	40

　　(3)膠配制好后，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，靜止放置使之聚合完全。　　[注意] 1、使用夾子固定玻璃板時，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過程中出現漏膠液現象。　　　　　　2、灌制凝膠的過程中要嚴防產生氣泡，否則影響測序的結果。　　（三）電泳：　　1、預電泳　　（1）當凝膠聚合完全后，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。　　（2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板后，方能加入TBE緩沖液。　　（3）稀釋10×TBE緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳槽中，去除產生的氣泡，接上電源準備預電泳。　　（4）有些電泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加熱的，則應先將水浴加熱至55℃后進行預電泳。有的不使用水浴加熱，依靠電泳過程中自身產生的熱進行保溫，如上海求精有機玻璃儀器生產的測序電泳槽，這種槽需夾上二塊散熱鋁板，使整個凝膠板的溫度一致。　　（5）按30V/cm的電壓預電泳20-30分鐘。預電泳的過程是去除凝膠的雜質離子，同時使凝膠板達到所需的溫度。高溫電泳可防止GC豐富區形成的發夾狀結構，影響測序的結果。　　[注意] 　　（1）. 用鯊魚齒梳制作加樣孔時，應注意將齒尖插入膠中0.5mm左右，千萬注意不能使加樣孔滲漏，否則得不到正確的結果。　　（2）. 應時刻注意上面電泳槽中的緩沖液是否滲漏，否則極易造成短路而損壞電泳儀。　　2、樣品的制備：　　當在預電泳時，即可進行樣品的制備，將反應完畢的樣品在沸水浴中加熱1-3分鐘，立即置于冰上即可。如果樣品長時間不用，則應重新處理。可使用4-6%聚丙烯酰胺凝膠，膠厚0.4mm。厚度小于0.4mm的膠可能導致信號太弱。加樣時不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地吸取礦物油下的藍色樣品。　　3、上樣及電泳　　關閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預電泳時擴散出來的尿素，然后立即用毛細管進樣器吸取樣品，加入樣品孔中。上樣順序一般為G、A、T、C。加樣完畢后，立即電泳。開始可用30V/cm進行電泳，5分鐘后可提高至40-60V/cm，并保持恒壓狀態。一般來說，一個55cm長，0.2mm厚的凝膠板，在2500V恒壓狀態下電泳2小時即可走到底部，同時在電泳過程中，電流可穩定地從28mA降至25mA。為了能讀到更長的序列，可采用兩輪或多輪上樣。　　[注意] 　　1、上樣電泳時，一定要注意凝膠板的溫度是否達到55℃左右，如果還沒有達到，則應等溫度達到后才能上樣電泳。　　2、一般來說電泳時，不宜使用太高的電壓，因為太高的電壓會使凝膠的分辨率降低，并且使帶擴散。電泳中可進行恒功率電泳。　　（四）、測序凝膠的銀染 　　染色過程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質量的水洗滌盤子。　　　　1. 電泳完畢后用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應該牢固地附著在短玻璃板上。　　　　2. 固定凝膠：將凝膠(連玻璃板)放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒,充分振蕩20分鐘或直至樣品中染料完全消失，膠可在固定/停止溶液中保存過夜(不振蕩)。保留固定/停止溶液，用于終止顯影反應。　　　　3. 洗膠：用超純水振蕩洗膠3次，每次2分鐘。從水中取出, 當轉移至下一溶液時拿著膠板邊沿靜止10-20秒，使水流盡。　　　　4. 凝膠染色：把凝膠移至染色溶液充分搖動30分鐘。　　　　5. 凝膠顯影：　　　(1). 在顯影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸鈉溶液(400μl)以完成顯影液的配制。　　　(2). 從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5-10秒。注意，把凝膠從超純水轉移到顯影溶液的總時間不能長于5-10秒。浸泡時間過長則導致信號微弱或喪失信號。若浸泡時間過長,可重復第五步用染色液浸泡。　　　(3). 立刻將凝膠轉移至1升(總量的一半)預冷的顯影液充分振蕩直至模板帶開始顯現或開始出現第一批條帶,把凝膠移入剩下的1升顯影液中繼續顯影2--3分鐘,或直至所有條帶出現。　　　　6. 固定凝膠：在顯影液中直接加入等體積的固定/停止溶液。停止顯影反應,固定凝膠。　　　　7. 在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2分鐘，注意在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋。　　8. 將凝膠置于室溫干燥或用抽氣加熱法干燥。在可見光燈箱或亮白，黃色背景(如紙)上觀察凝膠，若需永久保存的記錄, 則可用EDF膠片保留實驗結果。　　[注意] 　測序產物的銀染是顯現序列信息的一種新方法，本系統的成敗受幾個因素的影響。　　　　　　　　1. 水的質量對于染色的成功極其重要。超純水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或雙蒸水可獲得　　　　較好的效果, 如果水中有雜質, 則低分子量條帶可能無法出現。　　　　　　　　2. 碳酸鈉也非常重要。使用新鮮的，美國化學學會級碳酸鈉較好，如Fisher和Kodak ACS試劑　　　　級碳酸鈉(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可獲得較好的結果。　　　　　　3. 染色后的洗滌步驟是非常關鍵的。如果凝膠洗滌時間太長，銀顆粒會脫離DNA, 產生很少或　　　　沒有序列信號。如果洗滌時間過長，染色步驟可以重新進行。　　　　　　　　4. 如果凝膠厚度超過0.4mm或丙烯酰胺濃度高于4-6%，則有必要延長固定和染色的時間。如果　　　　凝膠比0.4mm薄，染色反應后的洗滌必須縮短至不超過5秒。　　　　　　　　5. 在室溫下進行所有步驟，顯影反應除外。顯影溶液必須預冷至10-12℃以減小背景雜色。注　　　　意：臨用前在顯影溶液中加入甲醛和硫代硫酸鈉。用新配的染色及顯影溶液。不要重復使用任何溶　　　　液。　　（五）、EDF膠片顯影 　　　使用EDF膠片可增強測序條帶的對比度，如果測序膠上條帶很淡，我們建議把數據轉移至EDF膠片，銀染膠在其影像轉移至EDF膠片之后可增強條帶可讀性。　　　　1. 在暗室內，將染色過的粘于玻璃板的凝膠(膠面向上)置于熒光燈箱上。如有合適的漫射板，亦可用白燈箱，為確保曝光時間, 用一小條EDF膠片曝光不同時間, 檢查不同的曝光強度, 一般曝光20--40秒可得較好結果。　　2. 在紅燈下找到EDF膠片有缺刻的一角, 然后把膠片置于凝膠上，使缺口位于左上角。由于EDF膠片是單面的，因此必須確保缺口在左上角。　　3. 在EDF膠片上放置一干凈、干燥的玻璃板，開亮燈箱約20秒。　　4. 用沖顯放射自顯影膠片的步驟手工顯影EDF膠片，可使用下列操作過程: 　　　　　a. 在Kodak GBX顯影液中顯影1-5分鐘; 　　　　　b. 水洗1分鐘; 　　　　　c. 在Kodak GBX定影液中定影3分鐘; 　　　　　d. 水洗1分鐘. 　　[注意] 1. 進行EDF膠片顯影之前凝膠必須完全干燥。戴手套進行操作, 以免印上指紋。同時注意　　　　　EDF膠片不能用自動膠片處理器。　　　　　　2. 對于不同的光源最佳曝光時間可能不同，通過對一小條EDF膠片曝光不同時間以選擇你所用　　　光源的最佳曝光時間，參閱膠片說明書。　　　　　　3. 曝光時間短則EDF膠片影像較深，曝光時間長則有助于減弱背景。

第二節 T7 DN A聚合酶測序技術

　　一、概述 　　T7 DNA聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及單鏈和雙鏈3'→5'外切酶活性。當T7 DNA聚合酶用適當方法處理后，可使3'→5'外切酶活力明顯下降。改造后的T7 DNA聚合酶又稱T7測序酶。使用T7測序酶得到的測序數據具有在每個堿基位置都有相對均勻的配對參入。因此, 放射自顯影所得到的結果較為清晰易辯, 對于許多模板來說, 使用含有dGTP的混合物即可得到理想的測序結果。然而, 如果出現了帶壓縮的問題，則用含dITP的混合物來取代常規的dGTP。dITP的摻入，使在富含GC的模板中也能有效地消除帶壓縮現象。　　T7測序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延續性，正因如此，該酶在使用中不同于Klenow片段和反轉錄酶。它幾乎沒有錯誤性的終止，整個反應在很短的時間內完成，并且不需要進行追加反應(Chase step)。然而對于有緊密二級結構的區域, 錯誤的終止反應會給閱讀序列帶來困難。如果碰到這些情況，應使用一些高溫DNA聚合酶，如Promega公司的測序級Taq DNA 酶。利用高溫DNA聚合酶獨有的耐熱特性，測序反應可在不利于形成二級結構的高溫條件下進行。　　T7 DNA聚合酶測序的快速而簡便的方法是從Klenow酶和AMV反轉錄酶測序的操作步驟修改而來的，它的最大優點是具有很高的5'-3'的DNA合成活性和極低的3'-5'端外切酶的活性。在測序過程中，若以同位素標記則相對于大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段Klenow，或反轉錄酶AMV而言，則可使條帶非常的均一，并且它的放射性背景極低。　　T7 DNA聚合酶測序時DNA的合成的過程是分二步完成的。第一步為標記反應階段，第二步方為雙脫氧鏈末端終止的DNA合成過程。在第一步過程中，引物的延伸是在較低濃度的脫氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反應過程中，已含有經放射性標記的dATP。第二步過程中，脫氧三磷酸核苷酸濃度提高，并且加入雙脫氧的三磷酸核苷酸，DNA 在合成過程中，因加入的雙脫氧三磷酸核苷酸而隨機終止，形成長短不一的DNA片段。　　二、材料 待測的DNA模板，可用雙鏈或單鏈模板。　　三、設備 高壓電泳儀，測序用電泳槽，照相顯影用大號塑料盆，制膠設備，吹風機，放射自顯影盒，X-光片。　　四、試劑 　　1、5×T7 DNA聚合酶緩沖液：200mmol/L Tris?Cl, pH7.5, 100mmol/L MgCl2, 250mmol/L NaCl。　　2、引物：使用通用引物pUC/M13正向或逆向引物。　　3、DTT ： 0.1mol/L。　　4、5×常規標記混合物：7.5mmol/L dGTP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。　　5、5×dITP標記混合物：15mmol/L dITP, 7.5mmol/L dCTP, 7.5mmol/L dTTP。　　6、dNTP A溶液（適用于dGTP): 80mmol/L dGTP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/L dTTP, 50mmol/L NaCL。　　7、ddG終止混合物 (適用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddGTP。　　8、ddA終止混合物 (適用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddATP。　　9、ddT終止混合物(適用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddTTP。　　10、ddC 終止混合物(適用于dGTP)：dNTP A溶液再加 8mmol/L ddCTP。　　11、dNTP B溶液（適用于dITP): 160mmol/L dITP, 80mmol/L dATP, 80mmol/L dCTP, 80mmol/L dTTP, 50mmol/L NaCl。　　12、ddG終止混合物(適用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddGTP。　　13、ddA 終止混合物(適用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddATP。　　14、ddT 終止混合物(適用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddTTP。　　15、dd C終止混合物(適用于dITP)：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddCTP。　　16、測序用T7 DNA測序酶。　　17、酶稀釋緩沖液：10mmol/L Tris?HCl, pH7.5, 5mmol/L DTT, 0.5mg/ml BSA 。　　18、終止溶液： 95%甲酰胺，20mmol/L EDTA, 0.05%溴酚蘭，0.05%二甲苯蘭。　　19、[a-32P]dATP 或[a-35S]-dATP, 35S的優點是可使條帶為窄而清晰，并且操作更為安全。放射強度為：1000-1500Ci/mmol，10mCi/ml。　　20、TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA, pH7.5。　　21、上節所述的凝膠制備過程中的全套試劑。　　22、X光顯影液：H2O：50℃ 800ml，米吐爾 2.2g，無水Na2SO3 72g，對苯二酚 8.8g，無水NaCO3 48g , KBr 4g，定容至1000ml備用。　　23、F-5堅膜定影液：水600ml , Na2S2O3 240g, Na2SO3 15g, 冰醋酸 13.4ml；硼酸 7.5g ，粉狀鉀礬 15g ，定容至1000ml 備用。　　24、TYP肉汁培養基：16g蛋白胨，16g酵母提取物，5g NaCl, 2.5g K2HPO4，加水溶解，定容至1000ml。　　25、20%PEG/3.75mol NH4Ac 溶液：40% PEG（分子量8000）儲備液和7.5mol/L pH7.2 NH4Ac儲備液等體積混合。　　五、操作步驟： 　　（一）、模板制備　　1、M13單鏈模板制備：在轉化入合適的大腸桿菌宿主菌且在含有指示劑如X-gal/IPTG的培養基上鋪板之后, 含有M13重組子的細胞將表現出無色的"噬菌斑"，事實上受感染的細胞并非被噬菌體溶菌或殺死，出現噬菌斑是因為被感染的細菌在生長速度上比其周圍未感染的細菌慢的緣故, 從無色噬菌斑上得到的感染細胞經培養便能產生測序反應所需的單鏈模板。　　　（1）過夜培養的宿主細胞(如NM522或JM101)用3ml TYP肉汁培養基以1:100稀釋。在37℃強烈震蕩1小時之后, 細胞進入對數早期。此時, 將一個合適的含有重組M13的噬菌斑(連同瓊脂)用滴管轉入該細胞培養液中。　　　（2）37℃強烈震蕩(300rpm) 培養6小時。　　　（3）把細胞培養液轉入兩只1.5ml eppendorf管, 12000g離心15分鐘。上清液轉移到新的eppendorf管再離心15分鐘。小心地取出1-1.2ml上清液(注意不能觸及沉淀), 再轉到新的eppendorf管。 . 　　　（4）將0.25體積的含20％PEG(-8000)的3.75M醋酸銨(pH7.5)加入上清液以沉淀噬菌體。混勻后置冰上30分鐘, 再以12000g離心15分鐘, 傾去上清液, 再以同樣方法離心一次, 用吸液器尖頭將殘留的PEG充分吸干凈。此時應能見管底有芝麻大小的噬菌體顆粒沉淀。　　　（5）將沉淀物重溶于400ml TE緩沖液中。　　　（6）加等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合液, 強烈震蕩1分鐘，12000g離心5分鐘。　　　（7）將水相轉入一新的eppendorf管, 注意不能觸動原管中兩相交界面。加等體積苯酚/氯仿(1:1)混合液, 強烈振蕩1分鐘, 12000g離心5分鐘。　　　（8）將上層水相轉入另一新的eppendorf管, 重復第7步的提取, 如有必要重復多次直至二相之間無可見物質存在。　　　（9）將上層水相轉入一新的eppendorf管, 加等體積氯仿, 強烈振蕩1分鐘后, 12000g離心5分鐘, 多次重復此步驟。　　　（10）將上層水相轉入新的eppendorf管, 加0.5倍體積的7.5 mol/L 醋酸銨, 2倍體積乙醇, 混勻后-20℃放置 30分鐘。　　　（11）12000g離心15分鐘, 去除上清液, 用70％乙醇小心清洗沉淀, 如果沉淀已被攪起, 重新離心, 傾去酒精, 真空干燥沉淀物。　　　（12）將DNA的沉淀物溶解于20ml去離子水中，取2ml樣品進行瓊脂糖凝膠電泳定量, 如果DNA量充足, 則可進行退火測序。　　2、噬粒(Phagemid)單鏈模板的制備：噬粒是指含有絲狀單鏈DNA噬菌體復制區的嵌合質粒。分子克隆中常用的pBluescript系列和pGEM系列的質粒均屬噬粒。含重組噬粒的細胞單菌落經液體培養并用輔助噬菌體超感染后就能產生測序反應所需的單鏈DNA模板。　　　（1）從新鮮平板上挑得含pGEM質粒DNA的抗Amp單菌落, 并接種到100ml含有50mg/ml氨芐的TYP肉湯培養基中, 在37℃振蕩過夜。　　　（2）取100ml過夜培養物接種到另一新的裝有5ml 含50mg/mlAmp的TYP肉汁培養基的試管中, 在37℃強烈振蕩30分鐘。　　　（3）加40μl輔助噬菌體R408或M13 K07, 繼續劇烈攪拌振蕩培養6-8小時，使輔助噬菌體超感染。　　　（4）12000g離心15分鐘后，去除沉淀，取上清，轉移到一新eppendorf管中再次離心15分鐘, 小心地取1-1.2ml上清液(注意不能觸及沉淀)。　　　（5）將0.25體積的含20％ PEG-的3.75M醋酸銨加入上清液以沉淀噬菌體顆粒。混勻后置冰上30分鐘, 再以12000g離心15分鐘, 傾去上清液, 再以同樣方法離心一次, 用移液器尖頭將殘留的PEG溶液吸凈。此時應能看到管底有芝麻大小的噬菌體顆粒沉淀。　　　（6）將沉淀物溶解于400ml TE緩沖液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA)。　　　（7）加等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合液, 強烈振蕩1分鐘, 再以12000g離心5分鐘。　　　（8）將水相轉入一干凈eppendorf管(不要觸動原管中兩相交界面), 加等體積酚/氯仿(1:1)混合液, 強烈振蕩1分鐘, 12000g離心5分鐘。　　　（9）上層水相轉入一干凈eppendorf管重復第8步驟提取, 如有必要重復多次直至二相之間無可見物質。　　　（10）將上層水相轉入一干凈eppendorf管加等體積氯仿, 強烈振蕩1分鐘后離心, 多次重復此步驟。　　　（11）將上層水相轉入一干凈eppendorf管加0.5倍體積7.5mol/L pH7.5醋酸銨, 再加2倍體積乙醇, 混和后-20℃放置30分鐘。　　　（12）12000g離心15分鐘, 去除上清液, 用70％乙醇小心清洗沉淀, 如沉淀已被攪起,重新離心, 傾去乙醇, 真空干燥沉淀。　　　（13）將沉淀物溶解于20ml去離子水中, 取2ml樣品進行瓊脂糖凝膠電泳進行定量，如果DNA量充足，則進行退火和測序。　　3、質粒膜板制備：參照第一章所述的方法。　　（二）超螺旋質粒DNA的堿變性：　　1、取4mg（約2pmol）超螺旋質粒DNA至一eppendorf管中，加無離子水到終體積18ml。　　2、加2ml 2mmol/L NaOH/2mmol/L EDTA 溶液, 置于室溫(25℃下）保溫5分鐘。　　3、加2ml 2mol/L NaAc溶液(pH4.6)渦旋混勻，使之中和。　　4、加75ml無水乙醇，充分混勻后，置于干冰或-70℃沉淀10分鐘。　　5、于12000g離心10分鐘，棄去上清，用200ml預冷的70%乙醇洗沉淀后，干燥沉淀，溶于20ml無離子水中。　　（三）、測序反應：　　1、引物和模板的退火：　　（1）在一離心管中，混合如下幾種試劑：　　　　引物約1-2pmol 　　　　5×T7 DNA聚合酶測序反應緩沖液 2ml 　　　　DNA 約1mg 　　　　加ddH2O終體積至10ml 。　　（2）將試管蓋蓋上后，65℃ 加熱2分鐘，然后在大約30分鐘左右的時間內，使試管的溫度緩慢地降到室溫。降溫的過程中可使用小的加熱板或小型的保溫儀，也可使用已調至65℃的水浴，使它們的溫度在室溫下緩慢地降至室溫即可。當溫度降至30℃以下時，退火結束。可將小試管置于冰上，退火完畢的模板須在4小時內使用。　　2、標記反應　　（1）在一個標準的反應過程中（從引物處開始，可讀到500個堿基以上），首先需要按1:5稀釋標記混合物。如4ml 混合物則加雙蒸無離子水16ml。該稀釋液儲存在 -20℃可使用數周。如果所要測定的序列小于30個堿基，可將標記緩沖液稀釋15倍，同時，模板DNA要高于0.5pmol。由于DNA模板量的不足，會降低標記反應的程度，即只標記引物后的幾個核苷酸。　　（2）用冰預冷的TE緩沖液按1:8稀釋T7 DNA聚合酶。酶液稀釋后應立即使用，置于冰浴不宜超過60分鐘。不得使用標記混合物、DTT溶液或非緩沖液類溶液稀釋酶液。　　（3）在已退火的引物 -模板混合物中，依次加入：　　　　0.1mol/L DTT 1.0ml 　　　　標記混合物 2.0ml 　　　　[a-35P]dATP或[a-35S]dATP 0.5ml 　　　　已稀釋好的T7 DNA聚合酶 2.0ml 　　混合充分（注意不得產生氣泡），置于室溫5-10分鐘。　　如果在電泳時碰到帶壓縮問題，則dITP 混合物的效果優于dGTP混合物，dITP混合物的使用方法與dGTP混合物的使用是相似的。　　[注意] 1、稀釋時應將所有的溶液預先混合完全后再加入酶液。　　　　　　2、在第（3）步的過程中，如果反應中有幾次冷卻，保溫的時間過長或溫度太高的話，則會使測序反應短于100個堿基。　　　　　　3、鏈終止反應：　　　　　　（1）取4支eppendorf管分別標上G，A，T，C。　　　　　　（2）每個管分別加入2.5ml G，A，T，C鏈末端終止混合物，立即蓋上蓋子以防液體蒸發（本反應最好在標記反應前做好）。dGTP和dITP混合物依據各自需要選用。　　　　　　（3）將eppendorf管預熱至37℃ 1分鐘。　　　　　　（4）待標記反應完畢后，取3.5ml標記反應液至上述4支eppendorf管中，稍微離心一下，并將上述四管置于37℃保溫。注意在每一次反應中，均應使用新的吸液頭，以免交叉污染。　　　　　　（5）繼續保溫3-5分鐘（若使用dITP時，保溫時間可延長至30分鐘，對反應產物沒有任何影響。　　　　　　（6）在上述四管中各加入4ml終止緩沖液。混合均勻后，置于冰浴中。本樣品即可上樣電泳。用35S標記反應的樣品可置于-20℃保存一周，此時樣品只有極少量的降解。而32P標記的則需在當天電泳以免降解。　　（四）測序凝膠板的制備及電泳參考第一節測序凝膠板的制備及電泳部分。樣品加熱至75-80℃ 2分鐘，立即上樣，每個泳道的使用量為2-3ml 　　（五）測序凝膠板的干燥及放射自顯影。　　電泳完畢后，經32P或35S標記的產物可用對b-射線敏感的X-光膠片放射自顯影檢測。　　1、取下電泳的玻璃板，去除兩邊的壓條，用小的薄鋼片撬開玻璃板。若玻璃板用粘合硅烷處理過，凝膠會緊緊地粘合于玻璃板上，則凝膠與玻璃板一起進行下面步驟的處理。如果玻璃板沒有經過粘合硅烷的處理，則可用3MM大濾紙貼在有凝膠的玻璃板上，小心地揭下凝膠，準備下一步的處理。　　2、去除尿素，將含有凝膠的玻璃板或濾紙浸于含有2升10%冰醋酸的大號顯液盆中，輕輕振蕩15分鐘，去除尿素。　　3、干膠：含有凝膠的玻璃板可用電吹風吹干，而含有凝膠的濾紙則可用專用的干膠設備如真空加熱干膠儀抽干。　　4、已經干燥的凝膠即可進行放射自顯影。在玻璃板含有凝膠的這一面加上X-光片后，用另一塊相似大小的玻璃板夾住，然后用夾子固定，置于暗盒中曝光。而含有凝膠的濾紙則可置于X-光曝光盒中放射自顯影。一般32P曝光過夜即可，而35S為2-3天。　　5、曝光完畢后的X-光片即可沖洗，獲得序列信息。將X光片置于水中先濕潤，然后置于顯影液中顯影，直至條帶清晰顯示為止。X-光片用水淋洗片刻后置于定影液中定影15分鐘以上。取出X-光片干燥并讀出序列。　　[ 注意] 1、去除尿素是非常重要的，如果有殘存的尿素，則在干膠過程中會使凝膠很粘，而無法進行放射自顯影。可以用10%冰醋酸洗二次，第一次15分鐘，第二次10分鐘。如果膠濃度高于12%，則有可能在干膠過程中會產生皺紋，防止的方法有二種：（1）冰醋酸溶液中加入1%-2%的甘油；（2）不干燥膠，直接在冰箱中以冰凍狀態曝光，應注意的是在使用這個方法時，要在凝膠和X-光片之間加一層薄的塑料薄膜。一般來說都使用第一種方法。　　2、凝膠一定要充分干燥方可進行曝光，否則X-光片會粘在膠的表面，致使以后的操作困難。　　3、曝光時間應根據所使用的同位素而定，如果同位素已過半衰期則應相應延長曝光的時間。

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