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第二節　染色方法

一、本科標抗體法

酶標抗體技術是通過共價鍵將酶連結在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位。

（一）酶的種類及特點

從理論上講，用細胞化學方法能顯示的酶，均可用于標記抗體，進行ICC染色，但實際上在ICC中所能用的酶并不多。現將常用的幾種酶列于表4-1，供選用時參考。

表4-1 免疫細胞化學常用的酶

名 稱 分 子 量 內 源 性 商 品 Horseeradish peroxidase(E.C.1,11,1,7) 40～45KD + 有 Alkaline phosphatase (E.C.3,1,3,1) 80～120Kd ++ 有 Acid phosphatase (E.C.3,1,3,2) 100Kd +++ 有 Glucose oxidase 160～190kD － 有

Sternberger(1986)指出，用于標記的酶應具備以下幾點①酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產物易于光鏡或電鏡下觀察；②所形成的終產物沉淀必須穩定，即終產物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學定位；③較易獲得的酶分子，最好有商品出售；④中性pH時，酶應穩定，酶標記抗體后，保存1～2年活性不應改變，且酶的催化活性（Turnover）越高越好；⑤酶標過程中，酶與抗體連結，不能影響二者的活性；⑥被檢測組織中，不應存在與標記酶相同的內源性酶或類似物質。

其中，①②兩點甚為重要，因為并非容易顯示的酶均能形成不可溶性的復合物。一般認為，辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase , HRP）較佳，是最常用的一種酶。HRP廣泛分布于植物界，以植物辣根（西洋山崳菜）的葉內含量最豐富而得名。它是由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結合組成的一種糖蛋白，糖占16%～18（8條糖鏈分布在HRP分子表面），分子量40kD，最適pH5～5.5，最適溫度40～45℃； pH4～11，50℃以下均較穩定，易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。酶的活性中心含鐵卟啉，稱輔基，最大吸收光譜為403nm，而其余非活性的酶蛋白部分吸收光譜為275nm，HRP的純度是用二者的光密度比值（Od 403/275）衡量，Reinheit Zahl (RZ)表示。一般認為，標記酶的RZ值為3.0左右，不應小于2.8，RZ值越小，酶的純度越差，例如RZ值為0.6的酶，含非活性的酶蛋白量高達75%。對于純度低、質量差的酶，需純化后使用。

除HRP外，堿性磷酸酶（Alkaline phasphotase, ALP）和葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD）也較常用。ALP分子量約為HRP的2～3倍，最適pH9.0～9.5左右，比較穩定，內源性ALP也較易消除，大部分均可被左旋咪唑（Levamisole,分子量240.8kD）抑制，但腸粘膜表面的內源性ALP活性不受影響。目前所用的ALP大多系由牛的腸粘膜提取制得，所以腸粘膜等呈強陽性反應。

ALP最初是由Bulman等用于標記抗體的。選用不同的底物，可形成不同顏色的終產物，例如以萘酚（As-Mx）和快藍（Fast Blue, FB）為底物，生成藍色沉淀。用快紅（Fast Red, FR）代替FB，形成紅色不溶沉淀。與HRP/4-氯-1-萘酚（CN）或DAB形成的沉淀形成鮮明對比，但FB、FR等沉淀物溶于有機溶劑，不能進行脫水、透明等處理。據報告，利用新品紅（New fuch－sine ）顯色，形成的紅色沉淀產物不溶于有機溶劑，不褪色，輕度核復染后，可制成半永久性保存標本。

GOD所催化的底物為葡萄糖，電子供體為對硝基四唑藍（P-Nitroblue Tetrazolium）,終產物為不溶性的藍色沉淀，比較穩定。從理論上講GOD較ALP、HRP為佳，因為哺乳動物組織內不存在內源性GOD，但其分子量較大，具有較多的氨基，在標記時易形成廣泛的聚合，影響酶的活性，故GOD主要用于ICC雙重染色和兩種酶的放大技術。

（二）本科標抗體的制備（Boosma,DM, 1983）

　　酶標抗體與熒光色素標記抗體不同，它需借助橋-偶聯劑的作用，將酶連結在抗體分子上。偶聯劑是一種雙功能 試劑 ，具備3個基本特征：①偶聯劑與抗體和酶之間的連結，必須是不可逆的，即借共價鍵連結；②偶聯劑不應影響酶和抗體的活性；③不能因偶聯劑的加入，使酶與組織成分了生非特異結合。

在HRP標記抗體中，常用的偶聯劑有戊二醛、過碘酸鈉及Maleimide等，現簡介如下。

1．戊二 醛標記法　　戊二醛為制備各種酶標抗體最常用的偶聯劑。市售戊二醛往往含有戊二酸、丙烯釋及戊二醛自身聚合本等雜質，故需純化后使用。戊二醛的純度用含雜質的二醛的單體戊二醛的OD比值表示，它們的最大吸收光波長分別為235nm 和280nm，二者的OD比值（235/280）小于3時，制備酶標抗體的效果較好，大于3時，需經蒸餾或Sephadex G-10柱層析或活性碳吸附等處理，除去雜質后應用。其制備方法分一步法和兩步法；基本原理相同，是使戊二醛的兩個醛基之一與酶蛋白的賴氨酸結合，另一醛基與免疫球蛋白上的氨基結合，將酶連結于抗體上。

（1）一步法：將酶、抗體、戊二醛按一定比例混合，經透析除去標記物中剩余的戊二醛，制得酶標抗體。優點是簡單省時，缺點是反應程度不易被控制，因為酶蛋白分子和抗體蛋白分子同戊二醛間的反應速率不同，抗體蛋白的氨基數遠較HRP為多，與戊二醛反應快，因此在戊二醛的作用下，抗體蛋白易通過分子內和分子間的彼此交聯，形成較大的聚合體，而與酶蛋白分子間的交聯相應減少，影響酶的標記。據Nakane等推算，加入的HRP僅20%與抗體連結，標記率較低（約1%～5%）很難獲得理想的酶標抗體。

（2）二步法：首先用過量的戊二醛與HRP反應（HRP：戊二醛為1：105），以保證酶分子僅與戊二醛的一個醛基結合，另一個醛基游離；然后用層析法除去多余的戊二醛，制成活性HRP（HRP-戊二醛復合物），再加入過量的抗體，使活化HRP上剩余的醛基與抗體蛋白分子上的氨基結合，制成酶標抗體。過量的抗體可以保證酶與抗體間均勻連結，避免酶本身聚合。根據所用的HRP與抗體（IgG）比例不同，酶標記率各異，平均為5%～25%。標記步驟如下：

①10～15mg HRP(RZ=3.0),溶解于0.2ml 1.25%戊二醛中（0.1mol/L磷酸緩沖液配制），18h室溫。

②透析或 Sephadex G-25柱層析（0.15mol/l NaCl平衡），去除過量的戊二醛，收集活化HRP。

③濃縮活化HRP至10mg/ml左右，加入抗體5mg(1.0ml 0.15mol/L NaCl 溶解)。

④碳酸鹽緩沖液（pH9.5）調整pH至9.0～9.5,使抗體與活化HRP結合，4℃24h。

⑤加入0.1ml賴氨酸緩沖液，阻斷未反應的醛基，4℃，2h。

⑥用半飽和硫酸銨沉淀5次，對PBS透析24h，4℃，換3次PBS，除去硫酸銨（10000rpm/min,30min）。

　　⑦或用凝膠 色譜 法（Sephadex G-200/Sephacryl S-200） 等分離標記抗體。

注意：該方法要求HRP的RZ值在3.0左右，游離氨基較少，與戊二醛反應后，制成的酶標抗體大部分為單體；而RZ值小于2.8的HRP，含有較多的游離氨基，與戊二醛反應后，易形成多聚體，使方法的敏感性下降。

2．過碘酸鹽氧化法　　嚴格地講，過碘酸鈉（Sudium periodate）不是一種真正的偶聯劑，其本身并非作為橋連結在抗體和酶之間，而是借助于過碘酸鈉的氧化作用，將酶連結在抗體上。該方法僅適于含糖較豐富的酶（如HRP）的標記。我們知道，HRP分子的糖本身與酶活性無關，利用過碘酸鈉氧化這部分糖分子內的-CH基，使之生成-CHO基，再與抗體蛋白的游離氨基反應，生成Shiff’s堿。此Shiff’堿在pH降低時呈可逆性解離，所以經氫硼化鈉（NaBH4）還原，形成穩定的酶標抗體復合物（圖4-1）。為防止生成的-CHO基與酶蛋白氨基自身交聯，預先可用二硝基氟苯（Dintro-fluorobenzene）處理HRP，阻斷分子內的ε-、α-氨基。

圖4-1　過碘酸鹽氧化原理

過碘酸鹽氧化法，酶的RZ值≥3時較佳；RZ<3時，糖含量較少，游離氨基較多，氧化時酶易發生本身聚合，影響酶標抗體的產量，據報告，適當地控制過碘酸鹽溶液及反應條件，幾乎所加入的HRP和抗體均形成酶標抗體，其標記率為70%左右。具體步驟為：

（1）4mg HRP(RZ=3.0)溶于1.0ml雙蒸水中。

（2）加0.2ml新鮮配制的0.1mol/LNaIO4，