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第七節　光鏡免疫金銀細胞化學方法

一、免疫金染色

（一）免疫金法（IGS）

1987年，Geoghegan等首次應用免疫金探針檢測B淋巴細胞表面抗原，建立了用于光鏡水平的免疫金法（Immunogold staining, IGS）。IGS的特點是染色程序簡便，不要顯色，就能檢測細胞表面的抗原，又能檢測細胞內抗原。染色時免疫金法一般要求金顆粒的直徑大于20nm，并且用的濃度較高。用IGS定位細胞抗原時一般都采用間接法，下面以人肝組織HBsAg的定位為例說明IGS的步驟：

（1）石蠟切片→脫蠟至水。

（2）0.1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。

（3）用雙蒸水振洗5＇×2。

（4）用0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。

（5）1%卵蛋白（EA）封閉10min。

　　（6）稀釋鼠抗HBsAg單克隆抗體（用0.02mol/l TBS pH8.2 作1：100稀釋），4 ℃ 過夜。

（7）0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。

（8）1%EA封閉10min。

（9）0.02mol/l TBS pH8.2 稀釋兔抗鼠金標抗體（1：8）37℃45min。

（10）0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。

（11）雙蒸水振洗5＇×2。

（12）1%戊二醛，10min。

（13）雙蒸水5min 。

（14）用蘇木素襯染核1min，甘油封片。

結果：在光鏡下可見部分肝細胞漿內有金顆粒聚集呈紅色，沿細胞膜分布，表明有HBsAg定位在細胞漿內。

（二）蛋白A-金（PAG）放大法

為了得到更明確的染色結果，在用IGS方法定位細胞抗原時可采用搭橋法，使IGS得到放大，這里介紹一種用抗A蛋白抗體作橋的PAG放大法。下面以5-羥色胺定位為例說明這一新方法。

（1）石蠟切片→脫蠟至水。

（2）1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。

（3）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5＇×2。

（4）1%EA封閉組織10min。

（5）用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀釋兔抗5-羥色胺抗體（1：1000）4℃過夜，或者37℃1h。

（6）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5＇×2。

（7）1%EA封閉10min。

　　（8）用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀釋PAG（1：40），37 ℃ 1h。

（9）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。

（10）1%EA封閉10min。

　　（11）抗A蛋白抗體（1：100）37 ℃。 45min。

（12）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。

（13）加0.05mol/l pH7.4 TBS稀釋PAG（1：40），37℃45min。

（14）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。

（15）雙蒸水振洗5min。

（16）1%戊二醛10min。

（17）雙蒸水振洗5min。

（18）0.01%伊文思藍2min，甘油封片。

光鏡下觀察，小腸粘膜內含有嗜銀顆粒的細胞胞漿呈紅色，陽性顆粒位于細胞核底部，比單純用PAG染色深度得到加深，陽性結果得到放大。由于抗A蛋白抗體既能通過Fab段又能夠通過Fc段與PAG上的A蛋白結合，因此，與其它橋抗體相比它能夠在抗原位點處聚集更多的膠體金顆粒。

　　PAG放大法的優點：①使用 試劑 單一；②可大大提高IGS的敏感性，從而使應用IGS方法定位抗原時使用高稀釋度的抗體成為可能；③背景干凈。可以預見這一新方法將很快受到人們的關注。

二、免疫金銀法

　　1983年，Holgate等人將IGS與銀顯影方法相結合創立了免疫金銀法（Immunogold―sliver staining, IGSS）IGSS的基本原理是通過免疫反應沉積在抗原位置的膠體金顆粒起著一種催化劑作用，用對苯二酚還原劑將銀離子（Ag + ）還原成銀原子（Ag o ）。被還原的銀原子于是圍繞金顆粒形成一個“銀殼”，“銀殼”一旦形成本身亦具有催化作用，從而使更多銀離子還原并促使“銀殼”越長越大“，最終抗原位置得到清楚放大。

（一）石蠟切片的IGSS染色

以人肝細胞內HBsAg定位舉例說明。

（1）切片常規脫蠟至水。

（2）Lugol＇s液，5min.

（3）5%硫代硫酸鈉水溶液脫碘5min。

（4）用雙蒸餾水沖洗干凈。

（5）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min兩次。

（6）用0.1%胰蛋白酶消化10min或用3mol/L尿素消化20min。

（7）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min一次。

（8）1%卵白蛋白封閉15min。

　　（9）馬抗HBsAg抗體1：1000稀釋，37 ℃ 1～2h 或4℃過夜。

（10）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min兩次。

（11）1%卵白蛋白封閉10min。

（12）1：40，PAG，37℃45min。

（13）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min兩次。

（14）雙蒸水洗5min，兩次。

（15）物理顯影見后所述。

（16）雙蒸水洗5min，兩次。

（17）蘇木素襯染。

（18）酒精常規脫水，透明，封固。

結果，光鏡下見肝細胞胞漿內有膜或包涵體形分布的陽性黑色狀顆粒，背景干凈。

（二）冰凍切片的IGSS染色

作冰凍切片的組織，若在動物試驗可以先經過固定液灌注或浸泡固定，也可不固定先做冰凍切片。人的組織也可通過浸泡固定或不固定，這主要根據保存抗原性的需要而定。固定過的組織可用20%蔗糖PBS（0.01mol/l pH7.2）浸泡2～4h或在切片時用OCT包埋，以減少冰凍切片過程中冰晶的形成。如果切片還準備用于電鏡包埋，則可經過5%，10%，20%濃度逐級遞增的蔗糖溶液。在冰凍切片前，可先入氟里昂?22 （Freon--22）驟冷，這樣可使組織的結構保存更好，適用于電鏡觀察。

（1）冰凍切片。

（2）Lugol＇s液，5min.

以下步驟同人肝HBsAg的染色方法。

（三）半薄切片的IGSS染色

IGSS染色的半薄切片，可以在光鏡下直接觀察陽性結果，為電鐿取陽性部位及觀察打下良好的基礎。