四）?測效價和制備文庫平板 1．?取?500ml?消毒培養瓶，注入?100ml?消毒?LB?培養液，再接種入?2ml?含有新鮮?LE392?細菌的麥芽糖液，培養至?OD600?近?1.0?。 2．?收集細胞分別于兩個帶螺旋帽?50ml?聚苯乙烯管中；?2500g?離心?10?分鐘。 3．?棄上清，把每一沉淀物重懸入?25ml?消毒的?10mM MgSO4?中。 4．?LE392?細胞在?4?℃中可存兩周；貯存過長會降低接種存活率。 5．?接種噬菌體和測效價：從每?250?μ?l?包裝反應液中取?1?μ?l?（從前（三）中?5?），加入到?99?μ?l TMG?中，分?1?μ l ?和?10?μ?l?此稀釋液加入?13mm?（直徑）×?100mm?（長）消毒管中；同時也稀釋和鋪制克隆載體平板、連接和包裝，但無插入（三種?A?管），作為本底對照。 6．?從?4?步驟向每管中加?200?μ?l LE392?細菌，混勻，室溫孵育?20?分鐘。 7．?加?2.5ml?含有?10 mM MgSO4?的上層瓊脂（?48?℃）；在室溫中把每管立即倒入瓊脂平板上，旋動，令上層瓊質分散均勻。 8．?室溫中置?5?分鐘，令瓊脂變硬，反置平板，?37?℃中培養?8~16?小時，當?LE392?細胞長滿后，由于溶菌作用，空斑形成將非常明顯。 9．?計算每一包裝反應效價，統計每一平板空斑數，理想濃度的插入片段的效價應是：如建立文庫成功，與無插入對照文庫相比，至少大?5~10?倍。 10．?????????放大：如需放大，應用足夠反應樣品去建庫，在最適條件下重復連接和包裝反應，但不擴大反應規模；對哺乳動物基因組，理想的目標文庫大小是?1~2?×?106?噬菌斑，合并包裝混合物，并通過倒平板計算噬菌斑數，用來測定其效價，或文庫的含量。 11．?????????以下?7?個步驟是倒平板供文庫篩選，如果篩選前要擴增文庫，則可按六、文庫擴增?法進行，然后再回到步驟?12?。 12．?????????文庫倒平板篩選：要篩選?5?×?105?~106?噬菌斑，一般每個?90mm LB?瓊脂平板上有?104?噬菌體；先取?20ml LE392?細胞；裝入?50ml?無菌帶帽塑料試管中，在細菌中加入已知效價的包裝混合液?5?×?105?~106?噬菌斑，混合。 13．?????????室溫中置?20?分鐘，令噬菌體附到細胞上。 14．?????????在?50~100?個?13?×?100mm?的無菌玻璃試管中各加?200?μ?l?受吸附的細菌。 15．?????????室溫下每管各加?2.5ml 48?℃融化的無菌?LB?上層瓊脂糖，并立即倒在?LB?瓊脂平板上，搖動使之分布均勻，連續倒完全部平板。 16．?????????室溫下置?15?分鐘，使上層瓊脂糖凝固，于?37?℃倒置培養?8~16?小時。 17．?????????此間將出現噬菌斑。 18．?????????4?℃保存平板。 ? 五）?用放射性探針篩選已倒平板的文庫 1.?將瓊脂平板翻轉，令瓊脂面下，去掉培養皿蓋，在室溫中空氣干燥?30?分鐘。 1．?給每個培養皿編號，用筆在對應的?NC?濾膜上編號。 2．?把濾膜小心地鋪在瓊脂平板上，編號朝上，濾膜?0.5~1?分鐘內變濕，持續?20?分鐘使噬菌斑吸附到?NC?濾膜上。 3．?用一根干凈的?18?號針頭穿過濾膜和瓊脂糖，戳?5~10?個孔，使濾膜在瓊脂糖膜上定位（此步很重要）。 4．?用扁鉗小心緩慢從平板上揭下濾膜，注意不要掀起含噬菌體的瓊脂糖層，用記號筆在培養皿底部標記針孔。 5．?令號碼面朝下，在室溫中置?30?分鐘讓濾膜干燥，每個平板可再影印第?2?張濾膜，此對消除假陽性信號很有用，因所有的真陽性應在兩張膜的同一位置上雜交，另外，第二張濾膜也可用第二種探針雜交。 6．?將濾膜相繼浸入?100ml?下列?3?種溶液中（?30~60?秒?/?每次）： a.?????0.2M NaOH?，?1.5M NaCl b.?????2?×?SSC?，?0.4M Tris pH7.4 c.?????2?×?SSC 每浸潤?25?張濾膜后更換一次溶液 7．?硝酸纖維素膜面朝上，放置在?Whatman 3mm?紙上，室溫種干燥?1?小時。 8．?80?℃真空干燥?2?小時。 9．?????用雜交緩沖液濕潤所有濾膜，切口平移的探針用緩沖液?-N?，合成探針用緩沖液?-S?。 10．??在?1?只?1L?燒杯中，放入濾膜和足夠量的雜交緩沖液，浸泡濾膜。 11．??準備雜交探針：將比活性為?108?cmp/?μ?g?的切口平移探針?0.25?μ?g?加到?1?個帶螺紋帽的?50ml?試管中，加?0.5ml 2mg/ml?的鮭魚精子?DNA?溶液，再依次加入下列溶液并振蕩混合使其變形：?10M NaOH 50?μ?l; 2M Tris pH7.4 300?μ?l; 1M HCl?（延壁加）?500?μ?l?。 12．??將此變性的探針加到放有濾膜和緩沖液的燒杯中，旋轉均勻。 13．??于?42?℃振蕩（輕輕搖動）?4~16?小時，使切口平移探針雜交（合成探針的保溫溫度不同）。 14．??倒出燒杯中的雜交緩沖液，用?500ml?含?0.1%SDS(W/V)2?×?SSC?溶液在室溫中搖動?15?分鐘。 15．??按步驟?15?再洗兩次，低鹽洗滌前用吸水紙吸干所有濾膜。 16．??用含?0.1%SDS(W/V)0.1?×?SSC 500ml?，?52?℃洗滌濾膜兩次，每次?15?分鐘。 17．??倒去洗滌緩沖液，用?Whatman 3mm?濾紙吸干濾膜，在空氣中干燥?1?小時。 18．??將?NC?濾膜貼在?3mm?濾紙上，用放射性墨水標記?3mm?濾值；濾膜用干凈塑料紙包好，用增強屏在?XAR-5?底片下于?-70?℃曝光過夜，檢測陽性信號。 ? 第二次篩選 19．??將?200?μ?l LE392?指示菌加到?13?×?100mm?試管中。加?2.5ml?含?10mM MgSO4?的?48?℃?LB?上層瓊脂，室溫下立即倒入?90mm?的?LB?瓊脂板上，靜止?5?分鐘使之凝固，形成細菌苔，在培養皿底劃?50?個格子，供第二次噬菌體的生長。 20．??按照膜上放射性墨水標記與?X?光底片對齊，用標記筆將膜上的位置孔標記在底片上，用透射光幫助對齊。 21．??根據放射自顯影信號，用牙簽挑取陽性噬菌體斑或其附近噬菌體。 22．??將牙簽上噬菌體斑，點在各個菌苔方格里，只要將牙簽尖在菌苔上輕輕觸一下即可。 23．??倒置平板，?37?℃培養過夜。 24．??加蓋?NC?濾膜，篩選，按步驟?1-19?進行。 ? 第三次篩選 25．??用牙簽轉移來自每一個原始陽性信號的第二輪單個雜交噬菌斑中的噬菌體，每個牙簽可轉移?106?~107?個噬菌體顆粒。 26．??將牙簽放進盛有?10ml?無菌?TMG?緩沖液的無菌管中，劇烈振蕩混合，以混勻噬菌體。 27．??將步驟?27?的?TMG?混合液?0.25?μ?l?和?2.5?μ?l?放入兩個含有?200?μ?l LE 392?倒平板細胞的?13?×?100mm?管子內，加?2.5ml 48?℃含?10mM MgSO4?的?LB?上層瓊脂，室溫下立即倒在?90mm?的?LB?瓊脂板上，搖動使之分布均勻，室溫下凝固?15?分鐘。 28．??倒置平板，?37?℃培養過夜，每個平板應形成?50~500?個噬菌斑。 29．??用干凈牙簽從?100~200?個單獨分開的噬菌斑中，把噬菌體轉移到長有?LE392?菌苔的平板上。 30．??倒置平板，?37?℃培養過夜。 31．??按步驟?1-19?對格子里的噬菌體作第三次雜交和篩選。陽性信號為純化的噬菌斑克隆，每一個來自初始陽性信號的“戰勝者”，按步驟?26?用牙簽轉移到?5ml TMG?液。 32．??加?1?μ?l TMG?混合液到?200?μ?l LE392?到平板細胞中，按步驟?28?和?29?進行，?37?℃倒置培養過夜。 33．??此平板上所有的噬菌斑，都是該克隆的純化噬菌斑，這平板可用?Parafilm?封柱，貯于?4?℃中，作為克隆的原種。平板上的單個噬菌斑，可直接用于這種噬菌體生長的制備。 ? 六）文庫擴增 1．?每?2?×?104?文庫中的噬菌體在一個無菌的?13?×?100mm?試管中同?200?μ?l LE392?細胞混合。一般說，擴增?2?×?106?個噬菌斑的文庫需?100?個試管，室溫下吸附培養?20?分鐘。 2．?在每個試管中加入含?10mM MgSO4?48?℃的軟瓊脂?2.5ml?室溫下立即倒在?90mm?的?LB?瓊脂板上，搖動鋪勻，不要倒轉平板，否則瓊脂會滑到一邊，?37?℃培養?6~10?小時。 3．?當噬菌體開始形成針尖狀噬菌體斑，而尚未變大連接成片時，加?2ml LB?培養液，用無菌塑料棒或彎曲的移液玻璃管從平板上刮下軟瓊脂，裝入一個無菌的?1L?燒杯中，每?100ml?體積平板上刮下的軟瓊脂中加?2ml?氯仿。 4．?在一末端為圓錐形的無菌離心管中，?3000g?離心混合物?10?分鐘，瓊脂和細菌碎片將在管底形成沉淀，輕輕倒出含有擴增文庫的上清液。 5．?測定文庫體積：加?NaCl?晶體至種濃度為?1M?。 6．?稀釋和倒平板，以測定擴增文庫效價，標準的效價為每?1ml 5?×?109?~1010?個噬菌體。 7．?將文庫分裝在?1ml?無菌管中，每管加?3?滴氯仿，?4?℃貯存。 8．?在倒平板和篩選前再測定文庫效價。