一、目的

1.了解感受態細胞生理特性及制備條件，掌握大腸桿菌感受態細胞制備方法。

2.掌握質粒DNA 轉化大腸桿菌的方法，了解轉化的條件和利用半乳糖苷酶基因插入失活選擇重組質粒DNA 的原理。

二、原理

（一）大腸桿菌感受態細胞制備的原理

所謂感受態，是指細菌生長過程中的某一階段的培養物，只有某一生長階段中的細菌才能作為轉化的受體，能接受外源DNA而不將其降解的生理狀態。感受態形成后，細胞生理狀態會發生改變，出現各種蛋白質和酶，負責供體DNA 的結合和加工等。細胞表面正電荷增加，通透性增加，形成能接受外來的DNA 分子的受體位點等。本實驗為了把外源DNA（重組質粒）引入大腸桿菌，就必須先制備能吸收外來DNA分子

的感受態細胞。在細菌中，能發生感受態細胞是占極少數。而且，細菌的感受態是在短暫時間內發生。

目前對感受態細胞能接受外來DNA 分子的本質看法不一。主要有兩種假說：

1、局部原生質體化假說――細胞表面的細胞壁結構發生變化，即局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，使DNA 分子能通過質膜進細胞。證據有：

（1）發芽的芽孢桿菌容易轉化；

（2）大腸桿菌的原生質體不能被噬菌體感染，卻能受噬菌體DNA 轉化；

（3）適量的溶菌酶能提高轉化率。

2、酶受體假說――感受態細胞的表面形成一種能接受DNA 的酶 位點，使DNA分子能進入細胞。證據是：（1）蛋白質合成的抑制劑如氯霉素，可以抑制轉化作用；

（2）細胞分裂過程中，一直有局部原生質化，但感受態只在生長對數期的中早期出現；

（3）分離到感受態因子，能使非感受態細胞轉變為感受細胞。

目前對感受態細胞的轉化理論尚未有統一結論，但是許多實驗室一直進行探索，試圖從實驗中獲得明確回答。有人根據pBR322 質粒DNA對E?coli K――12X1776菌株的轉化結果，認為：

近來，在許多研究室都發現CaCl2對受體菌處理，可提高轉化效率幾十倍，通常把細胞懸浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴條件下，放置過夜，轉化率轉高，但一過24小時，轉化率測恢復為原來的水平。

（二）重組DNA 的轉化原理

我們已經制備好大腸桿菌感受態細胞，接下的實驗是把重組的DNA 引入受體細胞，使受體菌具有新的遺傳特性，并從中選出轉化子。作為受體的大腸桿菌C600 或DH5α，必須不同外來DNA分子發生遺傳重組，通常是rec基因缺陷型的突變體，同時它們必須是限制系統缺陷或限制與修飾系統均缺陷的菌株。這樣外來的DNA分子不會受其限制酶的降解。保持外來DNA分子在受體細胞中的穩定性。制備的大腸桿菌細胞就具有這三種缺陷（rk- mk- rec- ）同時此受體細胞還是氨芐青霉素敏感（Ap）。

在體外構建好的重組分子上具有分解氨芐青霉素（Ap）基因存在，當它導入受體細胞后，就賦于這些受體細胞新的特性，即Ap 抗性。同時載體質粒上具有乳糖操縱的β一半乳糖苷酶基因(lacZ)，我們可以利用外源基因插入載體β一半乳糖苷酶基因(lacZ)，使其失去β一半乳糖苷酶活性的原理來選擇新構建的重組子。

因pUC18帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉化受體菌后只有帶有pUC18 DNA的轉化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來;而只帶有自身環化的外源片段的轉化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。

pUC18 上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和β-半乳糖苷酶N 端146 個氨基酸的編碼序列。這個編碼區中插入了一個多克隆位點,但并沒有破壞lacZ 的閱讀框架,不影響其正常功能。E.coli DH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C 端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情況下,pUC18 和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pUC18 和DH5α融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質。這種lacZ 基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實現互補的現象叫α-互補。

由α-互補產生的Lac 細菌較易識別，它在生色底物X-gal(5-溴-4 氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。當外源片段TGFβⅠ插入到pUC18 質粒的多克隆位點上后會導致讀碼框架改變,表達蛋白失活,產生的氨基酸片段失去α-互補能力,因此在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。由此可將重組質粒與自身環化的載體DNA 分開。此為α-互補現象篩選。