在已知基因部分核苷酸序列或全部核苷酸序列的情況下，基因的制備方法主要可分為兩大類：一類是基因化學合成法，一類是基因生物制備法。一般又可將基因生物制備法分為文庫法、cDNA 文庫法和PCR法等。

1 化學合成法。

就化學本質而言，基因是一段具有特定生物功能的核苷酸序列。如果知道了基因的分子結構，就可以進行基因的化學合成。有關DNA 的化學合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、亞磷酸酰胺法及固相亞磷酸酰胺法。磷酸二酯法是最初發明的化學合成基因的方法，而固相亞磷酸酰胺法是目前絕大部分DNA 自動合成儀所使用的方法。由于現代科學技術的發展，DNA 的化學合成已經廣泛采用DNA 自動合成儀進行，因此現在僅在少數特殊情況下，采用人工合成。

目前，化學合成基因的思路主要有兩條：

① 全基因合成，一般適于分子較小而不易獲得的基因。首先根據雙鏈基因序列，合成長度為40~60個堿基的寡核苷酸單鏈片段，并使每對相鄰互補的片段之間有4~6個堿基交叉重疊，然后將除基因兩個末端外的所有片段磷酸化，在混合復性后加入DNA 連接酶，即可獲得較大的基因片段。如果需連接的DNA 片段較多，可采用分步連接及克隆 的方法，最后將的較大片段重組為完整的基因。

② 基因的半合成，一般適于分子較大的基因。首先合成末端間有10~14個互補堿基的寡核苷酸單鏈片段，復性后以重疊區為引物，利用DNA 聚合酶I大片段或逆轉錄酶等催化合成反應，即可獲得兩條完整的互補雙鍵DNA 。

基因的化學合成法主要用于PCR擴增引物、核酸測序引物、核酸雜交探針和合成接頭等富核苷酸片段的合成。

2 文庫法。

基因組文庫法是一種直接從基因組中分離目的基因的方法。所謂基因組文庫（gene library或gene bank），是指匯集某一基因組所有DNA 序列的重組DNA 群體。高等真核生物染色體基因組文庫通常是以λ噬菌體作為載體構建的，有時也可以柯斯質粒作為載體構建。

利用λ噬菌體載體構建基因組文庫的一般操作程序如下：

① 選用識別序列均為4個核苷酸的兩種限制性內切核酸酶，對從某一高等真核生物組織細胞中提取的染色體基因組DNA 進行部分酶解，得到10~30 kb的 DNA 限制性片段，利用凝膠電泳法等從中分離出大小為 20 kb左右的隨機片段群體。

② 選用適當的限制性內切核酸酶酶解λ噬菌體載體DNA 。

③ 經適當處理，將基因組DNA 限制性片段與λ噬菌體載體進行體外重組。

④ 利用體外包裝系統將重組體包裝成完整的顆粒。

⑤ 以重組噬菌體顆粒侵染大腸桿菌，形成大量噬菌斑，從而形成含有整個DNA 的重組DNA 群體，即文庫。

具備了文庫，就可以適當的目的基因片段作探針，利用高密度的噬菌斑或菌落原位雜交技術，從大量的噬菌斑或菌落中篩選出含有目的基因的重組體的噬菌斑或菌落，再經過擴增提取其中的重組體，最后即可獲得所需要的目的基因片段。

3 cDNA 文庫法。

雖然可用基因組文庫法來獲取真核生物的目的基因，但是由于高等真核生物基因組DNA 文庫比其cDNA 文庫大得多，相關工作量同樣大得多。更為重要的是，在真核生物基因組中合有大量的間隔序列或內含子，但在大腸桿菌等原核生物中尚未發現類似序列的存在，大腸桿菌不能從真核生物基因的初級轉錄本中去除間隔序列，即不能表達真核生物DNA 。而在真核生物成熟mRNA 中已不存在間隔序列（已在拼接過程中被去除），以真核生物成熟mRNA 為模板，逆轉錄而成的cDNA 可被大腸桿菌表達。因此，在基因工程中，cDNA 文庫法是從真核生物細胞中分離目的基因的常用方法。

所謂cDNA 文庫，是指匯集以某生物成熟mRNA 為模板逆轉錄而成的cDNA 序列的重組DNA 群體。

cDNA 文庫通常以λ噬菌體和質粒作為載體構建。

構建cDNA 文庫的一般操作程序如下：

（1）總RNA 的提取。從細胞中提取RNA 與提取DNA 的方法基本相同。但是，由于RNA 因不易失活，因此在分離RNA 時，抑制RNA 酶的活性特別重要。常用的RNA 酶的抑制劑有異流氰酸胍、鹽酸胍、二乙基焦碳酸（DEPC）等。

（2）mRNA 的分離。真核細胞mRNA 一般為其總RNA 的1％～5％，每種特異mRNA 的量非常少。因此，要提取特異mRNA ，就需要選擇特異而高度分化的組織。在這些組織細胞中特異mRNA 所占的比例較大。真核細胞mRNA 的3端一般帶有poly（A）序列，這一重要特性常被用于從總RNA 中分離帶poly（A）的mRNA 。

（3）cDNA 雙鏈的合成。以poly（A）RNA 為模板，以olgo（dT）作引物，加人4種三磷酸脫氧核苷（dNTP），在逆轉錄酶的作用下，合成cDNA 第一鏈，在鏈的末端彎回形成一發夾結構；堿處理降解RNA 與DNA 雜交雙鏈中的RNA 模板鍵；以cDNA 第一鏈為模板，發夾結構為引物，在逆轉錄酶或DNA 聚合酶I（或其Klenow片段）作用下，利用4種三磷酸脫氧核苷（dNTP）合成cDNA 第二鏈；用特異切除單鏈的S1酶切去發夾環部分，最終得到平端雙鏈cDNA 。需要指出的是，逆轉錄能否形成全長cDNA ，取決于轉錄中所取的條件、模板的結構和純度。為了獲得全長cDNA ，并提高其在總cDNA 中的比例。需要注意：提高底物dNTP的濃度，或加入一定量的焦磷酸鈉等；加入氫氧化甲基汞或解鏈蛋白，以打開mRNA 的二級結構，使逆轉錄酶易于穿越mRNA 的特異性區域；加入RNase抑制劑，以防止污染的RNase對模板的降解作用；在合成cDNA 第二鏈時，采用無51→31外切核酸酶活性的大腸桿菌聚合酶I的Klenow片段，而不是全酶。

（4）cDNA 與載體的連接。

（5）噬菌體的包裝及轉染或質粒的轉化，形成大量噬菌班或菌落，從而形成以某生物成熟mRNA 為模板逆轉錄而成的cDNA 序列的重組DNA 群體即cDNA 文庫。

同樣，具備了cDNA 文庫，就可以適當的目的基因片段作探針，利用高密度的噬菌斑或菌落原位雜交技術，從大量的噬菌斑或菌落中篩選出含有目的基因的重組體的噬菌斑或菌落，再經過擴增，提取其中的重組體。最后即可獲得所需要的目的基因片段。

目前采用cDNA 克隆 技術已經分離了許多與園藝產品采后生理相關的基因，如在番茄cDNA 文庫中建立了146個與成熟相關的，得到了與果實硬度有關的PG基因，與乙烯生物合成有關的ACC合成酶基因、ACC氧化酶基因等。

4 PCR擴增法。

當已知目的基因的序列時，通常利用PCR（Polymerase Chain Reaction，即多聚酶鏈式反應）技術來分離目的基因。PCR技術是1985年由美國Cetus公司開發的專利技術，它能快速、簡便地體外擴增特定的DNA 片段，具有高度的專一性和靈敏度。而一些改進的PCR法可用于一些未知核苷酸序列核酸片段的特異擴增。在此，不再贅述。