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RNA 印跡雜交

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1）?????? Northern 印跡的制備

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預備：

1． 按下述步驟，每泳道加 10 ～ 20 μ g 總 RNA 或 0.5 ～ 1 μ g poly(A)+ RNA 進行甲醛 / 瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠放在紫外線透照儀上，旁邊置一標尺進行拍照。

a. 總 RNA （ 10 ～ 20 μ g ）用下列溶液在 65 ℃溫育 5min ：

b. 置冰浴迅速冷卻，加 2.5 μ l 上樣緩沖液，并加樣于按如下配制的甲醛 / 瓊脂糖凝膠中。

c. 加熱至 100 ℃溶解凝膠，然后置 50 ℃水浴箱降溫。加 17ml 甲醛，混勻并立即倒膠。須在通風櫥內帶手套操作，用一電泳槽專供 RNA 電泳。

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Northern 印跡

1． 當凝膠仍在電泳時，裁一張與凝膠大小相同的濾紙，以 20 × SSC 浸泡。

2． 安裝轉移裝置，盤內倒入雜交緩沖液（ 20 × SSC ）。在緩沖液平面上做一平臺，將凝膠盤倒置，并蓋三張經 20 × SSC 飽和的濾紙（ Whatman 3MM ），平臺兩端的濾紙應浸入緩沖液中，用 10ml 的玻璃吸管滾動以趕除氣泡并將濾紙推平。

3． 在濾紙表面倒入數 ml 20 × SSC ，將凝膠倒扣于濾紙上，小心趕除凝膠與濾紙間的氣泡，凝膠四周用膠布粘貼或用塑料薄膜包裹以防緩沖液直接從凝膠周圍流至紙中（虹吸短路）。

4． 用數 ml 20 × SSC 浸沒凝膠，置濾膜于凝膠上，確保凝膠與濾膜之間無氣泡。用軟鉛筆標記面對凝膠的濾膜面。

5． 濾膜表面放三張大小與濾膜相似并預先用 20 × SSC 浸泡的 3MM 濾紙。

6． 放一疊干燥吸水紙（印跡紙或紙巾）在 3MM 濾紙表面（約 5 ～ 8cm 高）。

7． 在折疊紙上放一玻璃板，并在玻璃板上置 0.75 ～ 1kg 重的物體。

8． 轉移進行 12 ～ 16 小時，確保槽內有足夠的 20 × SSC （約 3L ）。

9． 轉印后，小心拆卸印跡裝置，將凝膠與濾膜一起轉移到干燥濾紙上，凝膠在上。用軟鉛筆標記凝膠和濾膜加樣孔的位置，撕去凝膠。

10．? 以 20 × SSC 漂洗濾膜片刻以去除瓊脂糖殘跡。

11．? 將濾膜放在一塊干燥的 3MM 濾紙上稍微晾干。

12．? 固定 RNA 于濾膜上，將尼龍膜 RNA 面朝下在紫外透照儀照射 3 ～ 5min 。

13．? 此濾膜可用于雜交或 4 ℃保存，尼龍膜需要塑料袋密封。

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2 ） RNA 印跡雜交

1． 用 5 × SSPE 浸濕 RNA 濾膜。

2． 將浸濕的 RNA 濾膜轉移至塑料袋中，塑料袋四周封口并剪去一角。

3． 預熱預雜交液至 42 ℃，經塑料袋開口處加入 0.1ml/cm2 的預熱的預雜交液，小心移取，避免加入氣泡，從塑料袋中擠壓出所有氣泡，密封塑料袋。

4． 在 42 ℃水浴搖床中溫育塑料袋 2 ～ 4 小時，或將塑料袋夾于兩塊玻璃板中置 42 ℃烤箱 2 ～ 4h ，確保濾膜表面無氣泡。

5． 置 95 ℃ 10min 使探針變性，立即置冰浴冷卻 5min 。

6． 剪去雜交袋一角，將預雜交液倒入 15 或 50ml 的 Falcon 試管中，加入約 10 ～ 20ng/ml （隨機引物標記）探針，一般來說， 106 ～ 107 cpm/ml 已足夠，輕輕混勻。用一次性塑料移液管將雜交液加入裝有濾膜的塑料袋中。

7． 從塑料袋的開口處將氣泡全部壓出，用紙巾揩去流出的少許雜交液，小心封好袋口，避免液體漏出。必要的話，可將塑料袋套入另一個塑料袋內以防放射性污染。

8． 在 42 ℃水浴搖床中溫育 12 ～ 16h ，或夾在兩塊玻璃板中置 42 ℃烤箱溫育 12 ～ 16h 。

9． 雜交完畢，打開塑料袋的一角，將雜交液倒入 15 或 50ml 的 Falcon 試管中。小心不要使放射性溶液濺出。

10．? 將塑料袋完全打開，用鈍頭鑷子將濾膜轉移至盤中以便清洗，立即用緩沖液（ 2 × SSC ， 0.1 ％ SDS ） 1 漂洗濾膜。

11．? 室溫下，用漂洗緩沖液 1 漂洗三次，每次 5min 。

12．? 室溫下，用漂洗緩沖液 2 （ 0.25 × SSC ， 0.1 ％ SDS ）漂洗兩次，每次 5min 。

13．? 用預熱 45 ℃的漂洗緩沖液 2 漂洗 1 ～ 3 次，每次 15min 。在更換緩沖液之間，應用蓋革計數器檢測滯留在印跡中心的放射性。

14．? 充分漂洗后，把雜交膜放在一張 3MM 濾紙上稍晾干后，將潮濕的濾膜封在塑料袋內或用塑料薄膜包裹。

15．? 濾膜放射自顯影：將雜交膜（包裹在塑料袋內， RNA 面朝上）放在 X 射線暗盒底部，膠片放在其上。為方便起見，可將增感屏固定在暗盒蓋上，關閉暗盒，在－ 70 ℃曝光 1 天～ 2 周。

16．? 將暗盒從冰箱內移出時，應有足夠的時間（ 30min ～ 1h ）使其溫度調至平衡。在暗室將膠片從暗盒取出，并在自動 X 線底片處理儀上沖洗。

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3） 從雜交膜上除去探針

1． 煮沸 0.1 ％ SDS 溶液。

2． 把膜放在玻璃盤內，將溶液倒在膜上，涼至室溫。

3． 用蓋革計數器檢測降低的活性。

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