TNF-α生物學活性檢測方法

基本原理

TNF的生物學活性之一是能直接殺傷腫瘤細胞。TNF與相應受體結合后向細胞內移，被靶細胞溶酶體攝取導致溶酶體穩定性降低，各種酶外泄，引起細胞溶解。腫瘤細胞株對TNF-α的敏感性有很大的差異，用放線菌素D、絲裂酶素C、放線菌酮等處理腫瘤細胞，可明顯增強TNF-α殺傷腫瘤細胞活性。

材料和試劑

1，完全培養基（1）10%FCS-DMEM培養液（V/V）。

2，完全培養基（2）3%FCS-DMEM培養液（V/V）0.5-1μg/ml放線菌素-D。

3，0.05%結晶紫溶液：

取50mg結晶紫，用20ml無水乙醇溶解后，加水定容至100ml，室溫保存。

4，脫色液：

H2O 50mg

無水乙醇 50ml

乙酸 0.1ml

混勻即可。

5，TNF標準品：由中國藥品生物制品檢定所提供。

實驗操作

1，此實驗在無菌環境下進行，實驗前超凈工作臺應用紫外燈照射30分鐘以上。

2，用完全培養基（1）將生長狀態良好的小鼠L929細胞調至1×105/ml的細胞懸液，100μg/孔加入96孔細胞培養板，5%CO2，37℃培養過夜。

3，標準品稀釋：用完全培養基（2）將標準品進行10倍稀釋至100IU/ml為起始濃度，再做4倍稀釋上板。

4，待檢樣品稀釋：用完全培養基（2）將待檢樣品進行10倍稀釋至一定范圍，再做4倍稀釋準備上板。

5，棄96孔細胞培養板上清，將標準品及待檢樣品按100μl/孔加入96孔細胞培養板，同時設對照組和空白組，5%CO2，37℃培養16小時。

6，鏡檢后，棄上清，每孔加30μl 0.05%結晶紫染色3~5分鐘，用流水小心沖去結晶紫，甩干培養孔中的殘余水份，加入脫色液100μl/孔，用酶標儀測定570nm的光密度值。

結果計算

1，在座標紙上以OD570比色值（雙孔比色值的平均值）對稀釋倍數作圖，以標準品的最紙、最高平均值作平等于X軸的直線，以各相應樣品曲線與該直線的交點，在X軸讀出半效量的稀釋度。

2，計算公式：

TNF活性（IU/ml）=標準品效價×樣品預稀釋倍數/標準品預稀釋倍數×標準品半效量稀釋度/樣品相當于標準品半效稀釋度。