蛋白質定量實驗方法大全

LOWRY法蛋白定量專題

蛋白質定量貌似簡單的實驗，其實還是有一些學問的，蛋白質測定的方法有很多種，到目前為止還沒有哪種方法符合大眾所有的要求的，本文總結了Bradford斑點試驗、Coomassie 斑點試驗、紫外分光度檢測法以及BCA法.

一、Bradford法

該方法用于大多數蛋白質定量是相當精確的，特別是用于小分子多肽定量。如核糖核酸酶 或溶菌酶等。但是，去污劑的濃度超過0.2%則影響定量結果。如TritonX-100，SDS，NP-40等。

1. Bradford染液配制：將100mg考馬斯亮藍溶于50 ml 95%的乙醇中，加入100ml 濃磷酸，然后，用雙蒸水補充至200ml，放4C至少6個月。

2. 作標準曲線的蛋白質樣本的準備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準蛋白，例如進行抗體定量，可用純化的抗體作為標準蛋白。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標準蛋白。通常在20μg-150μg/100μl之間繪制標準曲線。

3. 將待測樣本溶于100μl緩沖溶液中，該緩沖溶液應于作標準曲線的緩沖溶液相同;

4. 按1：5用雙蒸水稀釋濃染料結合溶液，過濾離心沉淀物;

5. 每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5-30min。染液與蛋白質結合后，將由紅色變為藍色，即可在595nm光波長下測定其吸光度。注意，顏色反應不得超過30min;

6. 應用標準曲線計算待測樣本的濃度。

注意：應用Bradford法測定BSA 的值是其重量的兩倍。

二、Bradford斑點試驗

該方法特別適用于檢測洗脫組分，以定位蛋白洗脫液。例如檢測洗脫液的吸附力的強弱。

1. 首先，濃縮Bradford染液。將100mg考馬亮藍溶于50 ml 95%的乙醇中，加入100ml 濃磷酸，然后，用雙蒸水補充至200ml，放4C至少6個月。這種染液也可從Bio-Rad公司購到;

2. 將8μl待測蛋白質樣本轉移至一 條Parafilm，Saran Wrap上或微孔板孔中。同時應設一洗脫液樣本作為空白對照;

3. 每個樣本孔中加2μl濃Bradford染液并混勻;

4. 大約2min后，含有蛋白質的樣本將變藍。該方法的靈敏度約為10μg/ml。此反應對去污劑的濃度超過0.2%時非常敏感。但KCl，NaCl，MgCl2 或EDTA 對其無影響，Tris對其僅有輕微的影響。

三、Coomassie 斑點試驗

該方法特別適用于檢測洗脫組分以定位蛋白洗脫液。例如檢測洗脫液的吸附力的強弱。

1. 裁剪3MM厚的Whatman 紙約4mm2 ;

2. 每個樣本點5μl于Whatman 紙上;

3. 自然干燥樣本或用電吹風吹干斑點，約1min或更少;

4. 將紙塊浸入0.25%的考馬斯亮藍溶液中(考馬斯亮藍溶于10%的甲醇，7%醋酸中) 30min;

5. 將紙塊放入10%的甲醇，7%醋酸溶液中洗滌3-5 min，然后干燥。

四、紫外分光度檢測法

蛋白質紫外光吸光率是所有的蛋白質定量方法中最快的方法。通常在280nm光波長下讀數。其在280nm光波長下的最大吸光率主要處決于酪氨酸和色氨酸的存在。在205nm光波長的吸收也常用到。其在205nm光波長下的最大吸光率主要處決于肽鏈，盡管氨基酸也有影響。另外，一個主要的優點是在測定蛋白質濃度時，樣本不會遭到損害。

1、純蛋白質溶液：

① 在280nm光波長下讀取與適當的對照相比較的吸光率;

② 對于抗體和BSA，可應用下表計算其濃度對其他蛋白質可粗約地估計：1個單位吸光率相當于1mg/ml。

蛋白質 A280 (1mg/ml)

IgG 1.35

IgM 1.2

BSA0.7

2、含有核苷酸的蛋白質溶液

① 在280nm和260nm或280nm和205nm光波長下讀取與適當的對照相比較的吸光率;

② 用下列等式粗略計算其濃度：

蛋白質濃度(mg/ml)=(1.55×A280 )-(0.76×A260 )

蛋白質濃度(mg/ml)= A205 /(27 + 120 A280/ A205 )

五、BCA法：

由標準曲線可以算出樣品原始濃度為14.28mg/ml

BCA法特點： 1. 靈敏度高，檢測濃度下限達到25μg/ml，最小檢測蛋白量達到0.5μg，待測樣品體積為1-20μl 。 2. 測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的去污劑等化學物質的影響，可以兼容樣品中高達5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。 3. 在20-2000μg/ml濃度范圍內有良好的線性關系。 4. 檢測不同蛋白質分子的變異系數遠小于考馬斯亮藍法蛋白定量。 5. 受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巰基乙醇低于1mM

BCA法和Commassie法各有優勢，在不知道蛋白樣本緩沖液成分的情況下可以兩種方法配合使用，以消除定量的誤差。

Bradford法、Coomassie 法、紫外分光度檢測法以及BCA法各有優缺點，要根據實驗的目的去選擇合適的蛋白定量方法，主要依據是緩沖液的化學組成和待測的蛋白的濃度。