免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法，是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。

當蛋白質處于正常天然構象時, 某些抗體所識別的表位未能暴露出來, 這種情況下需要采取下列方法進行變性蛋白的免疫沉淀。

所需溶液和試劑

注意：所有溶液均需要用 Milli-Q 超純水或是相當純度的其他水配制。

1. 變性細胞裂解液：50 mM Tris (pH 7.5), 70 mM β-巰基乙醇 (β-ME)。β-ME 需新鮮加入，加入后先煮 10 分鐘。

2. 細胞裂解液 (1X): 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X- 100, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4，1 μg /ml Leupeptin.

注意：使用之前加入 1 mM PMSF。

3. 蛋白 A 瓊脂糖微球：取 1.5 g 蛋白 A 瓊脂糖微球加入到 5 ml 的 1X PBS 中。4 °C 緩慢攪拌 2 小時。離心沉淀微球，用 PBS 清洗兩次。將微球重懸在 1 倍體積的 PBS 中。（處理后的微球可以在 4 °C 存放 2 周）

4. 3X SDS 上樣緩沖液：187.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 25 °C), 6% w/v SDS, 30% 甘油, 150 mM DTT, 0.03% w/v 溴酚藍。

細胞裂解樣品制備

1. 吸去培養基。加入含調控因子的新鮮培養基，處理所需的時間。

2. 在非變性條件下收集細胞，棄去培養基，用 PBS 清洗一次。

3. 棄去 PBS，每個板（150 x 25 mm）中加 0.4 ml 變性細胞裂解液（使用前預煮 10 分鐘）。

4. 立即將所有細胞刮下，收集到 2.5 ml 的管中。

5. 沸水中煮 10 分鐘。

6. 加入 4 倍體積（1.6 ml）冰冷的 1 X 細胞裂解液。所得即細胞裂解物。如有必要，樣品裂解物可以保存在 –80 °C。

免疫沉淀

1. 將一抗加入到 200 μl 細胞裂解物中，在 4 °C 的轉子上孵育過夜。

2. 加入 20 μl 50% 漿狀的蛋白 A 瓊脂糖微球。在 4 °C 的轉子上孵育 1～3 個小時。

3. 4 °C 離心 30 秒。沉淀用 500 μl 細胞裂解液洗五次，洗完置于冰上。

4. 將沉淀用 20 μl 3X SDS 上樣緩沖液重懸沉淀。渦旋震蕩，離心 30 秒。

5. 把樣品放在 95～100 °C 加熱 2 - 5 分鐘。

6. 取 15 - 30 μl 樣品，上樣到 SDS-PAGE 膠（12～15%）上。

7. Western 免疫印跡分析檢測。