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植物 體內的可溶性蛋白質大多數是參與各種代謝的酶類，測其含量是了解植物體總代謝的一個重要指標。在研究每一種酶的作用時，常以比活(酶活力單位/mg蛋白)表示酶活力大小及酶制劑純度。因此，測定植物體內可溶性蛋白質是研究酶活的一個重要項目。常用測定方法有Lowry法和考馬斯亮藍G-250染料結合法。本實驗將分別介紹這兩種方法。

一、考馬斯亮藍法

【原理】

考馬斯亮藍G-250測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。考馬斯亮藍G-250在游離態下呈紅色，當它與蛋白質的疏水區結合后變為青色，前者最大光吸收在 465nm，后者在595nm。在一定蛋白質濃度范圍內(0～100μg/ml)，蛋白質-色素結合物在595nm波長下的光吸收與蛋白質含量成正比。故可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速，其結合物在室溫下1h內保持穩定。該反應非常靈敏，可測微克級蛋白質含量，所以是一種比較好的蛋白質定量法。

【儀器與用具】

分光光度計 ，10ml量筒1支；研體；10ml容量瓶1支；1ml刻度吸管3支；10ml具塞刻度試管14支。

【試劑】

(1)牛血清白蛋白 配成1000μg/ml和100μg/ml；

(2)考馬斯亮藍G-250：稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml 90%乙醇中，加入85%(W/V)磷酸100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml。此溶液在常溫下可放置一個月；

(3)90%乙醇；(4)磷酸(85%，W/V)。

【方法】

1.標準曲線的繪制

(1)0～100μg/ml標準曲線的制作 取6支試管，按表28-1數據配制0～100μg/ml血清白蛋白液各1ml。準確吸取所配各管溶液0.1ml，分別放入10ml具塞試管中，加入5ml 考馬斯亮藍G-250試劑，蓋塞，反轉混合數次，放置2min后，在595nm下比色，繪制標準曲線。

表28-1 配制0～100μg/ml血清白蛋白液

(2)0～1000μg/ml標準曲線的制作 另取6支試管，按表28-2數據配制0～1000μg/ml牛血清白蛋白溶液各1ml。與步驟(1)操作相同，繪出0～1000μg/ml的標準曲線。

表28-2 配制0～1000μg/ml血清蛋白血液

2.樣品提取液中蛋白質濃度的測定 吸取樣品提取液0.1ml(樣品提取見各酶活測定)，放入具塞刻度試管中(設兩個重復管)，加入5ml考馬斯亮藍G-250試劑，充分混合，放置2min后在595nm下比色，記錄吸光度值，通過標準曲線查得蛋白質含量。

3.結果計算

樣品蛋白質含量(mg/g鮮重)=

式中 C-查標準曲線所得每管蛋白質含量(mg)；

V-提取液總體積(ml)；

a-測定所取提取液體積(ml)；

W-取樣量(g)。

二、LOWRY法

【原理】

Lowry法是雙縮脲法和福林酚法的結合與發展，其原理是：蛋白質溶液用堿性銅溶液處理，形成銅-蛋白質的絡合鹽，再加入酚試劑后，除使肽鏈中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等顯色外，還使雙縮脲法中肽鍵、堿性銅的顯色效果更強烈。因此，Lowry法的顯色效果比單獨使用酚試劑強烈3～15倍，為雙縮脲法100 倍。由于肽鍵顯色效果增強，從而減小了因蛋白質種類引起的偏差。

Lowry法的試劑由兩部分組成，試劑甲相當于雙縮脲試劑(堿性銅溶液)，可與蛋白質中的肽鍵起顯色反應；試劑乙為磷鎢酸和磷鉬酸混合液，在堿性條件下極不穩定，易被酚類化合物還原生成鉬藍和鎢藍混合物而呈藍色反應，因此蛋白質的酪氨酸和胱氨酸等可顯色，顏色深淺與蛋白質含量成正比。

【儀器與用具】

試管若干；刻度吸管0.5ml，1ml，10ml；定量加樣器；圓底燒瓶；冷凝管一套(帶橡膠管)；微量滴定管；小燒杯；微量進樣器50μl；分光光度計。

【試劑】

Na2WO4·2H2O；Na2MoO4·2H2O；85% H3PO4；濃HCl；Li2SO4·H2O；溴水；酚酞指示劑；Na2CO3；NaOH；CuSO4·5H2O；酒石酸鉀鈉；

牛血清白蛋白：用水配成250mg/ml。

【方法】

1.酚試劑的制備

(1)取Na2WO4·2H2O 100g，Na2MoO4·2H2O 25g 及蒸餾水700ml于1500ml的圓底燒瓶中，之后加入85% H3PO4 50ml，濃HCl 100ml。安上回流冷卻裝置(使用磨口接頭。用軟木塞或橡皮塞時，必須用錫泊包起來)，使其慢慢沸騰10h。冷卻后加入Li2SO4·H2O 150g，水50ml，濃HCl 100ml安上回流冷卻裝置，開口加熱煮沸15min，以逐出過量的溴。冷卻后稀釋至100ml，并過濾入棕色瓶中，密閉于冰箱中保存。

使用時用標準NaOH溶液滴定，以酚酞為指示劑。滴定終點由藍變灰。滴定后算出酸濃度，用時適量稀釋，使最后濃度為1mol/L H+，此為Folin-酚試劑乙液。

(2)首先配制①4% Na2CO3溶液；②0.2mol/L NaOH溶液；③1% CuSO4溶液；④2%酒后石酸鉀鈉溶液；使用前①與②等體積混合配成Na2CO3-NaOH溶液；將③與④等體積混合配成硫酸銅一酒石酸鉀鈉溶液。然后將這兩個溶液按50︰1混合；配成Folin-酚試劑甲液。此試劑只能用一天。

2.標準曲線的繪制

(1)取7只試管編號,分別加0ml，0.1ml，0.2ml，0.4ml，O.6ml，0.8ml，1.0ml標準蛋白質溶液，用水補到1ml，便成為每管含蛋白為0mg，25mg，50mg，100mg，150mg，200mg，250mg標準系列(必要時可做重復)。

(2)加5ml試劑甲，混勻，于30℃放置10min。

(3)噴射加入0.5ml試劑乙，立即振蕩混勻，在30℃下保溫30min。

(4)準確到30分后，以不加標準蛋白的管為空白，在500nm波長下比色測定吸光度值。

(5)以蛋白濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

3.樣品測定

(1)取50μl樣液加入試管中，(樣液提取一般按0.1g鮮樣/ml比例，提取方法見各酶活測定)加蒸餾水補至1ml，然后重復步驟2的(2)，(3)，(4)，以空白為參比，測吸光度值。

(2)根據吸光度值，查標準曲線求得蛋白質含量。

4.結果計算

蛋白質含量(mg/g鮮重)=

式中 C-查標準曲線得樣品測定管中蛋白質含量(mg)；

V-提取液總量(ml)；

a-測定時取樣液量(ml)；

W-取樣量(g)。

【注意事項】

1.Folin試劑乙只在酸性條件穩定，故當其加到堿性的銅-蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞前，還原反應即能發生。

2.為了保證反應進行完全，反應在25～30℃水浴中進行，反應30min后準時比色。

3.還原物質干擾本實驗。

【方法評述】

上述兩種方法均是靈敏度為微克級的高靈敏度定量測定蛋白質方法，前者穩定，后者簡便；二者均優于現有的其它方法。二者的缺點是：Lowry法受植物體內存在的酚類物質干擾；考馬斯亮藍法在蛋白質含量很高時線性關系稍偏低，且不同蛋白質與色素結合狀況有差異。