Northern Blotting技術專題

探針 準備

DIG標記的RNA探針與DNA探針相比，顯示較強的雜交信號和較地的非特異性背景，因此，只要可能選用RNA探針可以比DNA探針獲得更好的雜交結果。如果必須使用DNA探針，建議使用高SDS雜交緩沖液或DIG Easy Hyb以減少背景。

在正式雜交試驗之前，優化雜交探針濃度是避免顏色背景所必須的。探針濃度的確定可通過模擬雜交進行。取一小片空白膜，將其浸入不同探針濃度的溶液中(如：1μl/ ml、3μl/ ml、5μl/ ml …)，可觀察到背景顏色的濃度即可作為雜交探針濃度。在采用熒光檢測或采用CSPD化學發光檢測時，建議試驗探針濃度50-100ng/ml，如果采用CDP-Star化學發光檢測，由于靈敏度很高，在此探針濃度下會產生很高的背景，因此，要適當降低探針濃度。

B. 印跡條件

對于1%的變性瓊脂 糖膠向尼龍膜上印跡轉膜，在10×和20×的SSC鹽濃度下可以獲得相同的結果，轉膜時間是在4℃或室溫下過夜。

C. 試劑及其配制

MOPS緩沖液(10×): 200mmol/L MOPS ( pH 7.0 )

50mmol/L NaAc

10mmol/L EDTA

上樣染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚藍，0.4%二甲苯藍

甲醛(37%溶液，13.3mol/L)

染液：0.5mol/L NaAc(pH 5.2)中含0.04%的亞甲藍

甲酰胺(去離子)

70%乙醇

SSC(20×)：3mol/L NaCl (175g/L)

0.3mol/L 檸檬酸三鈉•2H2O (88g/L)

用1mol/L HCl調整至pH 7.0

Denhardt溶液(100×)：10g Ficoll 400 + 10g PVP + 10g BSA(Penta x組分V)

用DSPC處理水溶解，定容至500ml，過濾后分裝成每份25ml于-20℃保存。

預雜交溶液：5× SSC

5× Denhardt 溶液

50%(w/v) 甲酰胺

1%(w/v) SDS

100μg/ml 鮭魚精DNA(用前加熱變性后加入)

雜交溶液：DIG-RNA探針用預雜交液稀釋成適當濃度

2×洗膜緩沖液：2×SSC 加入0.1% SDS

0.5×洗膜緩沖液：0.5× SSC加入0.1% SDS

0.1×洗膜緩沖液：0.1× SSC加入0.1% SDS

D. Northern轉膜

轉膜前的RNA瓊脂糖凝膠電泳參照RNA分離中的電泳方法，根據需要選用適當的 分子量Marker.

1.在一個標準變性凝膠電泳完成后，凝膠用DMPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于 2×SSC(20×SSC用DMPC-H2O稀釋)中浸泡15～30min.。

2.構建轉移平臺：在塑料盒上橫放一塊玻璃板，玻璃板應比塑料盒長，但比塑料盒窄。剪一塊與盒子等寬但長度是盒子長度2倍的濾紙，將其橫放在玻璃板上，濾紙兩頭垂入盤中，用20×SSC浸濕濾紙，并向盤中加入足量的20×SSC。

3.用鋒利的小刀將凝膠邊緣無用部分修去，并在靠加樣孔的一放左上角切去一小塊作為凝膠方位的記號。將凝膠置于平臺中央，用玻棒滾動除去氣泡，然后用石蠟膜封住凝膠四周邊緣，避免覆蓋樣品部位。

4.剪一片與凝膠暴露面同樣大小的尼龍膜，在無RNase的水中浸泡5min.，然后將其放置在凝膠上面，膜的一條邊緣應剛好重疊覆蓋于加樣孔的邊緣。膜置于凝膠表面后即不應輕易挪動，膜與凝膠之間不應留有氣泡。

5.取兩張與尼龍膜同樣大小的濾紙，用20×SSC浸濕后置于膜的上方，用玻棒趕出氣泡。切一疊略小于濾紙的紙巾，將其置于濾紙上方，在紙巾上平放一玻璃板，然后在玻璃板上壓一重物，室溫下轉膜4～6小時或4℃過夜。

在轉膜過程中，要保證塑料盤中有足夠的20×SSC，當紙巾浸濕后，要及時更換。

6.拆卸轉膜裝置，翻轉凝膠和膜使凝膠的一面朝上，置于一張干的濾紙上，用軟鉛筆在膜上標記凝膠加樣孔的位置。

7.取下凝膠，用2×SSC洗膜，再置于兩張干濾紙上使膜晾干。

8.交聯：方法1. 將膜夾于兩張濾紙之間，在80℃真空烘烤0.5～2小時;方法2. 將膜置于一可透過紫外線的塑料保鮮膜中，將有RNA的一面朝下，用紫外透射儀照射合適時間。帶正電荷的尼龍膜適度照射可促進RNA上小部分堿基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯結構，從而增強雜交信號。但過度照射確會使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共價結合于尼龍膜表面，導致雜交信號減弱。

對于濕潤的尼龍膜，總照射劑量為1.5 J/cm2，而干燥尼龍膜總照射劑量為0.15 J/cm2。

9.轉膜效果檢測：如果需要，可對轉移上RNA的膜進行染色檢查轉膜效果。將交聯后的膜浸入5%冰醋酸中，于室溫浸泡15min.，再將膜轉移至亞甲藍染液中，室溫下浸泡5～10min.。可見明顯的5s和18s兩條RNA帶，mRNA呈現模糊帶型。

E.雜交

建議雜交條件：探針濃度50~100ng/ml，溫度68℃過夜。

1.將印跡膜置于裝有預雜交液的雜交袋中(每100cm2膜20ml預雜交液)，封好雜交袋，在設定的雜交溫度下預雜交至少1小時。

2.將探針在沸水浴中變性10min.(探針一經變性，立即使用)，用預雜交液稀釋成設定濃度。

3.將雜交袋中預雜交液棄去，加入稀釋好的含有探針的雜交液，在設定雜交溫度條件下(68℃)雜交過夜。

4.雜交完成后，將雜交液回收置于一可耐低溫又可沸水浴的試管中，貯存于-70℃以備重復使用。重復使用時，解凍并在68℃下變性10min.。

5.洗膜：雜交膜取出后用2×洗膜緩沖液室溫下洗膜2次，每次15min.，除去非結合探針以減少背景。接下來用0.5×洗膜緩沖液洗膜2次，每次15min.，洗膜溫度42℃，然后再在0.1×洗膜緩沖液中洗膜2次，每次15min.，洗膜溫度68℃。當探針長度小于100bp時，最后一次的洗膜溫度要經過預備試驗確定。