Northern Blotting技術專題

A.質粒 DNA的小量提取

試劑及其配制

含AP的LB液體培養基

TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)

1mmol/L EDTA (pH 8.0)

溶液I： 25mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)

10mmol/L EDTA

50mmol/L 葡萄糖

高壓滅菌15min.后，4℃貯存。

溶液II: 0.2mol/L NaOH

1% SDS(臨用前現配制)

溶液III(100ml)：5mol/L 乙酸鉀 60ml

冰乙酸 11.5ml

dH2O 28.5ml

4℃貯存。

酚∶氯仿(1∶1)

95%和70%乙醇

試驗程序

1.在純凈工作臺上將5ml含AP的LB液體培養基加入到一10~15ml通氣良好的試管中，然后將前述經鑒定含有目的DNA片斷的轉化細菌 接種其中，37℃下振蕩培養過夜。

2.取1.5ml培養物置于一微量離心管中，在4℃下12000rpm離心2min.，棄去上清液，使細菌沉淀盡可能干燥。

3.將細菌沉淀重懸于100μl溶液I中，劇烈振蕩后加入200μl新配制的溶液II，蓋緊離心管口，將其快速顛倒5次(切勿振蕩)，再加入150μl在冰上預冷的溶液III，蓋緊離心管口，將其倒置后輕輕地振蕩使溶液III在粘稠的裂解物中分散均勻，再將離心管置于冰上3~5min.。

4.在4℃下12000rpm離心5min.，將上清液移至另一離心管中。

5.加入等量酚∶氯仿(1∶1)，振蕩混勻，在4℃下12000rpm離心2min.，將上清液轉入另一離心管中。

6.加入二倍體積95%乙醇，振蕩混勻，室溫放置20min.，在4℃下12000rpm離心5min.，小心棄去上清液，倒置將液滴除盡。

7.用70%乙醇洗滌一次，室溫干燥10min.，用50μl含20μg/ml胰RNA酶(無DNA酶)的TE重新溶解質粒DNA，取1μl 在含溴化乙錠的微型膠上進行電泳檢測，其余置于-20℃保存備用。

B. 質粒DNA的線性化

試劑及其配制

Not I和Sal I內切酶及其相應的緩沖液

酚∶氯仿(1∶1)

3mol/L NaAc(pH 5.2)

100%和70% 乙醇

DEPC-H2O

試驗程序

1.在離心管中依次加入：質粒DNA 10μl (1μg/μl)

10×內切酶緩沖液 10μl

dH2O 80μl

Sal I或Not I 2μl(10U/μl)

2.37℃保溫反應2小時以上。

3.消化液用100μl的酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次，每次在在4℃下12000rpm離心5min.

4.將上清液轉入一新的離心管中，加入0.1倍體積3mol/L乙酸鈉和2倍體積乙醇沉淀過夜。

5.4℃下12000rpm離心20min.，棄去上清液，沉淀用70%乙醇洗滌一次，真空干燥。

6.線性化質粒DNA按0.25μg/μl的濃度重懸于DEPC-H2O中，取10μl電泳檢測線性化質量，其余于-20℃下保存備用。