Western免疫印跡(western blot )是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。

一、 原理

與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。

以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原 ，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

二、分類

現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發表文章通常是用底物化學發光ECL。只要買現成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下(二抗用HRP標記)：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。

三、主要試劑

1、 丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應以溫熱(以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水 配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O至 100ml。)儲于棕色瓶，4℃避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0，因可以發生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。

2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子水配制，室溫保存。

3、 分離膠緩沖液:1.5mmol/L Tris-HCl (pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/L HCl 混合，加水稀釋到100ml終體積。過濾后40℃保存。

4、 濃縮膠緩沖液:0.5mmol/L Tris-HCl (pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml 1mol/L HCl調至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調節PH值，而不用 Tris.CL。

5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應受到抑制。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數ml，臨用前配制.

6、 SDS- PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍1.6ml，H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100μg。

7、 Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。

8、 轉移緩沖液：配制1L轉移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至總量1L。

9、 麗春紅染液儲存液：麗春紅S 2g 三氯乙酸30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應予以廢棄。

10、 脫脂奶粉5%(w/v)。

11、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。

12、 Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCl(pH7.5)，500mmol/LnaCl。

13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。

14、 過氧化物酶標記的第二抗體。

15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。

16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。

17、 100mmol/LTris-HCl(pH9.5)。

18、 100mmol/L NaCl。

19、 50mmol/LTris-HCl(pH7.5)，5mmol/L EDTA。(可以參看分子克隆)

四、主要步驟

搜集了現階段幾乎網上所有的Western Blot的中英文資料，僅供實驗參考，可以根據自己實驗的實際情況進行調整：Western Blot PROTOCOL;

五、 實驗常見的問題指南

根據問題的類型主要分成以下幾類(以下資料權作參考，請勿盲目模仿!);

1. 參考書推薦

A. 對初學者看什么資料比較好?解答：《抗體技術實驗指南》和Antibodies(a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane)兩本書不錯。

2. 針對樣品的常見問題

B. 做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot (以下簡寫成Western Blot)，提取線粒體后凍存(未加蛋白酶抑制劑)，用的博士德的一抗，開始還有點痕跡，現在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎?

解答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反復凍融;2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗濃度。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

C. 同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎?

解答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。

D. 如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么?

解答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

E 我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉膜時經常會發現只有一部分蛋白轉到了膜上，就是在轉膜后染膠發現有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決?

解答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉移時你可以用減少電流延長時間，多加5-10%甲醇。

F. 想分離的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適?積層膠的濃度又該用多少?這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎?

解答：260kd的蛋白不好做， 分離膠用6%， Stacking Gel 3.5%。

G. 如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量?如果需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚。

解答：可以濃縮樣品，也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30%是不會有問題的。如果已經超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的 comb。

H. 蛋白變性后可以存放多久?

解答：-80℃，一兩年沒有問題。最關鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉;不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。

I. 我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應當采用7.5%，但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11%的配方，不知為何?

解答：上述您提到的兩種凝膠均可以使用，因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內，但需注意條帶位置。

J. 接下來我準備采用DAB顯色技術，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調整，能否再用5%的脫脂奶粉呢?好像有資料說脫脂奶粉會影響親和素生物素的生成，是嗎?

解答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用BSA代替應該好一點.

K. 還有一問題，一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關系嗎?

解答：Western Blot一般上樣30-100微克不等，結果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時間都有關系，也與顯色時間長短有關。開始摸條件時，為了拿到陽性結果，各個步驟都可以量多一點時間長一點，當然背景也就出來了。要拿到好的結果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復地試了，當然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結果不容易。