一、 目的

掌握Folin-酚法測定蛋白質含量的原理和方法，熟悉分光光度計的操作。

二、原理

Folin-酚試劑法包括兩步反應：第一步是在堿性條件下，蛋白質與銅作用生成蛋白質-銅絡合物；第二步是此絡合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin 試劑）還原，產生深藍色（磷鉬藍和磷鎢藍混合物），顏色深淺與蛋白質含量成正比。此法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100 倍，定量范圍為5～100μg 蛋白質。Folin 試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋白質因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同。

三、實驗材料、主要 儀器 和試劑

1．實驗材料

綠豆芽下胚軸（也可用其它材料如面粉）

2． 儀器

（1）722 型（或721 型）分光光度計

（2）4 000r/min 的離心機

（3）分析天平

（4）容量瓶（50mL）

（5）量筒

（6）移液管（0.5mL、1mL、5mL）

3． 試劑 （純度均為分析純）

（1）0. 5mol/L NaOH

(2) 試劑 甲：

（A）稱取10g Na 2 CO 3 ，2g NaOH 和0.25g 酒石酸鉀鈉，溶解后用蒸餾水定容至500mL。

（B）稱取0.5g CuSO 4 ·5H 2 O，溶解后用蒸餾水定容至100mL。每次使用前將（A）液50 份與（B）液1 份，即為試劑甲，其有效期為1d，過期失效。

（3）試劑乙：

在1.5L 容積的磨口回流器中加入100g 鎢酸鈉（Na 2 WO 4 ·2H 2 O）和700mL 蒸餾水，再加50mL 85 ％磷酸和100mL 濃鹽酸充分混勻，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流結束后，加入150g 硫酸鋰和50mL 蒸餾水及數滴液體溴，開口繼續沸騰15min，驅除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色（倘若仍呈綠色，再滴加數滴液體溴，繼續沸騰15min）。然后稀釋至1L，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存，使用前大約加水1 倍，使最終濃度相當于1mol/L。

四、操作步驟

1．標準曲線的制作

（1）配制標準牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精確稱取0.0250g 結晶牛血清白蛋白，倒入小燒杯內，用少量蒸餾水溶解后轉入100mL 容量瓶中，燒杯內的殘液用少量蒸餾水沖洗數次，沖洗液一并倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，則配成250μg/mL 的牛血清白蛋白溶液。

（2）系列標準牛血清白蛋白溶液的配制：取6 支普通試管，按表1 加入標準濃度的牛血清白蛋白溶液和蒸餾水，配成一系列不同濃度的牛血清白蛋白溶液。然后各加試劑甲5mL，混合后在室溫下放置10min，再各加0.5 試劑乙，立即混合均勻（這一步速度要快，否則會使顯色程度減弱）。30min 后，以不含蛋白質的1 號試管為對照，用722 型分光光度計于650nm 波長下測定各試管中溶液的光密度并記錄結果。

（1）標準曲線的繪制：以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標，以光密度為縱坐標繪制標準曲線。

2．樣品的提取及測定

（1）準確稱取綠豆芽下胚軸1g，放入研缽中，加蒸餾水2mL，研磨勻漿。將勻漿轉入 離心管 ，并用 6mL 蒸餾水分次將研缽中的殘渣洗入 離心管 ，離心4 000r/min、20min。將上清液轉入50mL 容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，作為待測液備用。

（2）取普通 試管 2 支，各加入待測溶液1mL，分別加入試劑甲5mL，混勻后放置10min，再各加試劑乙0.5mL，迅速混勻，室溫放置30min，于650nm 波長下測定光密度，并記錄結果。

五、結果計算

計算出兩重復樣品光密度的平均值，從標準曲線中查出相對應的蛋白質含量X（μg），再按下列公式計算樣品中蛋白質的百分含量。

六、附注

（1）進行測定時，加Folin 試劑要特別小心，因為Folin 試劑僅在酸性pH 條件下穩定，但此實驗的反應只是在pH10 的情況下發生，所以當加試劑乙（Folin 試劑）時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前即能發生還原反應，否則會使顯色程度減弱。

（2）本法也可用于游離酪氨酸和色氨酸含量測定。

七、思考題

1．含有什么 氨基酸 的蛋白質能與Folin-酚試劑呈藍色反應？

2．測定蛋白質含量除Folin-酚試劑顯色法以外，還可以用什么方法？

參考答案

1．含有酚基的 氨基酸 （酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）能與Folin-酚試劑反應呈藍色，因為Folin-酚試劑在堿性溶液中極不穩定，易被酚類化合物還原為藍色化合物（鉬蘭和鎢蘭混合物）。

2．除Folin-酚試劑顯色法以外，紫外吸收法也可以進行蛋白質含量的測定。蛋白質在280nm 下具有最大的吸收值，這是由于含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所引起的。若將已知不同濃度的蛋白質在280nm 處測定，并作標準曲線，即可求得未知溶液的蛋白質濃度。