過氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳

一、目的

1、了解聚丙烯酰胺凝膠電泳原理

2、了解聚丙烯酰胺凝膠的制作過程

3、了解過氧化物酶同工酶電泳過程

二、實驗原理：

1、電泳原理及影響電泳的主要因素

帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動，這種現象稱為電泳。用電泳技術分離、分析蛋白質、酶、核酸等生物大分子，有較高的分辨率，目前已成為生物科學研究中必不可少的手段之一。帶電離子在電場中的泳動速度（1）和遷移率（泳動度）（2）

V= E·q·a/6πrη (1) u= q·a/6πrη (2)

由（2）式可以看出，凡能影響溶液粘度η的因素如溫度，影響分子帶電量q及解離度a的因素如pH的改變，都會對遷移率產生影響。因此，電泳應盡可能在恒溫條件下進行。并選用一定pH的緩沖液。同時，所選用的pH以能擴大各種被分離物質所帶電荷量的差異為好，以利于分離各種成分。遷移率與粒子的大小（r）有關，非球形粒子（如DNA）在電泳過程中會受到更大的阻力，即粒子的移動速度還與粒子形狀有關。

另外，遷移率還受電滲現象的影響。所謂電滲是指在電場中，液體對于固體支持物的相對移動。例如在紙電泳中，由于濾紙（纖維素）上帶有負電荷，因感應相吸而使與濾紙相接觸的水溶液帶正電荷，從而使液體向負極移動，帶動著本來是向負極泳動的物質以更快的速度移動。因此，電泳時應避免用高電滲物質作支持介質。聚丙烯酰胺凝膠結構中不帶電荷，在電場中電滲現象極為微小。這些特點，使得聚丙烯酰胺凝膠適合作區帶電泳的支持介質。

最后，要考慮選用離子強度適宜的溶液。一般低離子強度比較合適，因為此時導電性低，產生的熱量較少。同時可使被分離的帶電離子對電流貢獻最大從而加快電泳速度。但也不能過低，它必須可以緩沖被分離樣品中帶電離子對凝膠pH的影響，且過低的離子強度易導致蛋白質凝聚。一般最適的離子強度在0.01～0.1mol/L之間。最常見的為0.05。

在稀溶液中，離子強度Ⅰ可用下式計算： Ⅰ＝1/2ΣmiZi2 (3) （3)式中，mi為離子的摩爾濃度，Zi為離子的價數。

2、聚丙烯酰胺凝膠

聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為載體的一種區帶電泳。這種凝膠是以丙烯酰胺單體（Acrylamide，簡寫為Acr）和交聯劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（N,N’-Methylena Bisacrylamide，簡寫為Bis）在催化劑的作用下聚合而成的。

Acr和Bis在它們單獨存在或混合在一起時是穩定的，且具有神經毒性，操作時應避免接觸皮膚。但在具有自由基團體系時，它們聚合。引發產生自由基團的方法有兩種，即化學法和光化學法。

化學聚合的引發劑是過硫酸銨 (NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，簡寫為Ap），催化劑是N，N，N’,N’-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，簡寫為TEMED）。在催化劑TEMED的作用下，由過硫酸銨（Ap）形成的自由基又使單體形成自由基，從而引起聚合作用。冷卻可使聚合速度變慢；一些金屬抑制聚合；分子氧阻止鏈的延長，防礙聚合作用。這些因素在實際操作時都應予以控制。

光聚合以光敏感物核黃素（即VB2）作為催化劑，在痕量氧存在下，核黃素經光解形成無色基，無色基被氧再氧化成自由基，從而引起聚合作用。

聚丙烯酰胺的基本結構，為丙烯酰胺單位構成的長鏈，鏈與鏈之間通過甲叉橋聯結在一起。鏈的縱橫交錯，形成三維網狀結構，使凝膠具有分子篩性質。網狀結構還能限制蛋白質等樣品的擴散運動，使凝膠具有良好的抗對流作用。此外，長鏈上富含酰胺基團，使其成為穩定的親水凝膠。

聚丙烯酰胺凝膠的質量主要由凝膠濃度和交聯度決定。每100ml凝膠溶液中含有的單體（Acr）和交聯劑（Bis）總克數稱為凝膠濃度，用T％表示。凝膠溶液中，交聯劑（Bis）占單體（Acr）和交聯劑（Bis）總量的百分數稱為交聯度，用C％表示。改變凝膠濃度以便適應各種樣品的分離。一般常用7.5％濃度的聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質，而用2.4%的分離核酸。但根據蛋白質與核酸分子量不同，適用的濃度也不同（見表1）。 表1 凝膠濃度選用表

3、不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理

系統的不連續性表現在以下幾個方面：

1）凝膠板由上、下兩層膠組成，兩層凝膠的孔徑不同。上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。 濃縮膠：又稱堆積膠。凝膠濃度較小，孔徑相對較大。把較稀的樣品加在濃縮膠上，經過大孔徑凝膠的遷移作用二被濃縮在一個狹窄的區帶，使樣品組分在分離膠中得以高分辨率的分離。

分離膠:又稱電泳膠，通常孔徑較小，通過選擇合適的凝膠濃度，使樣品組分得以很好地分離。分離膠又分為均一膠和梯度膠。

2）緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。本實驗采用堿性系統。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液。而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。

3）在電場中形成不連續的電位梯度。在這樣一個不連續的系統里，存在三種物理效應，即電荷效應、分子篩效應和濃縮效應。在這三種效應的共同作用下，待測物質被很好地分離開來。下面以本實驗要分離的小麥苗過氧化物酶同工酶為例，分別說明三種效應的作用：

（1）電荷效應：各種酶蛋白按其所帶電荷的種類及數量，在電場作用下向一定電極，以一定速度泳動。

（2）分子篩效應：分子量小，形狀為球形的分子在電泳過程中受到阻力較小，移動較快；反之，分子量大、形狀不規則的分子，電泳過程中受到的阻力較大，移動較慢。這種效應與凝膠過濾過程中的情況不同。

（3）濃縮效應：待分離樣品中的各組分在濃縮膠中會被壓縮成層，而使原來很稀的樣品得到高度濃縮。其原因如下：

① 由于兩層凝膠孔徑不同，酶蛋白向下移動到兩層凝膠界面時，阻力突然加大，速度變慢。使得在該界面處的待分離酶蛋白區帶變窄，濃度升高。

② 在聚丙烯酰胺凝膠中，雖然濃縮膠和分離膠用的都是Tris-HCl緩沖液，但上層濃縮膠為pH 6.7，下層分離膠為pH8.9。HCl是強電解質，不管在哪層膠中，HCl幾乎都全部電離，Cl－布滿整個膠板。待分離的酶蛋白樣品加在樣品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸緩沖液中。電泳一開始，遷移率最大的Cl－迅速跑到最前邊，成為快離子（前導離子）。在pH6.7條件下解離度僅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）遷移率最低，跑在最后邊，成為慢離子（尾隨離子）。這樣，快離子和慢離子之間就形成了一個不斷移動的界面。在pH6.7條件下帶有負電荷的酶蛋白，其遷移率介于快慢離子之間，被夾持分布于界面附近，逐漸形成一個區帶。

由于快離子快速向前移動，在其原來停留的那部分地區成了低離子濃度區，即低電導區。因為電位梯度V、電流強度I和電導率S之間有如下關系：

V＝I/S (4)

所以在電流恒定條件下低電導區兩側就產生了較高的電位梯度。這種在電泳開始后產生的高電位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢離子加速前進，追趕快離子。本來夾在快慢離子之間的酶蛋白區帶，在這個追趕中被逐漸地壓縮聚集成一條更為狹窄的區帶。這就是所謂的濃縮效應。

當酶蛋白和慢離子都進入分離膠后，pH從6.7變為8.9，甘氨酸解離度劇增，遷移率迅速加大，從而趕上并超過所有酶蛋白分子。此時，快慢離子的界面跑到被分離的酶蛋白之前，不連續的高電位梯度不再存在。于是，此后的電泳過程中，酶蛋白在一個均一的電位梯度和pH條件下，僅按電荷效應和分子篩效應而被分離。與連續系統相比，不連續系統的分辨率大大提高，因此已成為目前廣泛使用的分離分析手段。

4、過氧化物酶同工酶電泳

同工酶是指其催化的化學反應相同，而酶的結構、理化性質乃至免疫性質不同的一組酶。植物在發育過程中，所含同工酶的種類和比例都不相同，它們與植物的遺傳、生長發育、代謝調節及抗性等都有一定關系，因此作為基因表達的產物，測定同工酶譜是認識基因存在和表達的一種工具，在植物的種群、發育及雜交遺傳的研究中有重要的意義。

過氧化物酶是植物體內普遍存在的、活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關系。在植物生長發育過程中它的活性不斷發生變化，測定這種酶的活性或其同工酶，可以反映某一時期植物體內代謝的變化。

利用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定同工酶，方法簡便，靈敏度高，重現性強，測定結果便于觀察、記錄和保存。本實驗采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術，分離、鑒定土豆、豆芽過氧化物酶同工酶。

同工酶染色：根據酶的生物化學反應，通過染色方法顯示出酶的不同區帶。過氧化物酶能催化過氧化氫使聯苯胺氧化成藍色或棕色產物，據此即可將該酶在凝膠中顯色定位。

三、實驗材料、儀器與試劑

1、材料 土豆與豆芽

2、儀器：

DYCZ-24E電泳槽、DYY-11型和DYY-12型三恒多用電泳儀、臺式高速離心機、微量進樣器、芬蘭可調移液器，研缽、50ml燒杯，量筒、大培養皿等玻璃器皿

3、試劑：

電泳試劑貯存液配置見附表(附表1)

染色液成分：抗壞血酸70.4mg,聯苯胺溶液(2g聯苯胺溶于18ml溫熱冰醋酸中,再加入蒸餾水72ml)20ml,0.6%(或1.2%)過氧化氫20ml,蒸餾水60ml。

四、實驗步驟

① 安裝制膠模具（教師演示，學生安裝）

注意事項：a、在整個過程中要輕拿輕放，以免將玻璃板弄碎。

②制作分離膠(濃度10%)

分離膠配方(濃度10%):pH8.9 Tris-HCl溶液:0.8ml

分離膠PAG溶液:1.2ml

蒸餾水:1.6ml

10%TEMED:40μl

%AP: 40μl

將上述溶液充分混勻,立即全部倒入安裝好的制膠玻板中,為使分離膠界面平整,可在倒入分離膠后約5min后在其表面沿高板緩慢均勻加入0.5ml蒸餾水并將電泳槽輕輕敲擊桌面。再靜置40min左右,讓分離膠凝聚完全。

③制作濃縮膠(濃度2.4%)

濃縮膠配方(濃度2.4%):pH6.7 Tris-HCl溶液:0.42 ml

濃縮膠PAG溶液:1.25ml

40%蔗糖溶液:1.25ml

10%TEMED:30μl

10%AP: 30μl

將上述溶液充分混勻,在聚合完全的分離膠上,倒入濃縮膠,（注意在倒入濃縮膠前要去掉分離膠表層的水）同時插入梳子,直到溶液裝滿和梳子插平為止。再靜置40min左右,濃縮膠聚合完全后為乳白色。

（注意事項：A、在整個過程中要將制膠模具垂直方在桌面上，不容許傾斜。B、充分混勻的（分離膠或濃縮膠）溶液應盡快用移液槍延高板的一側慢慢加入膠板中

C、膠制作完成后，松開卡板取下橡膠皮，然后再用卡板卡緊膠板。要注意低板在內側。）

④制樣：取適量(2g)的馬鈴薯于研缽中,加1ml的PBS(磷酸緩沖液,pH7.4),于冰上研磨至勻漿狀,收集在1.5ml的離心管中,在臺式離心機中以8000rpm離心5min，取上清,即為粗酶提取液,其中含有所需的APX。另外,豆芽研磨可取4g左右,同樣加入1ml的PBS。

⑤點樣

在濃縮膠聚合完畢后,小心取出梳子,兩拇指和食指捏住梳子的柄,其余三指頂住制膠框兩側,勻速地拔出梳子,然后向電泳槽中倒入預冷的電極緩沖液（原液要稀釋10倍）,緩沖液要沒過低板。

點樣前,要對樣品進行預處理,即把粗酶提取液與甘油溴酚藍指示劑以4:1混合,用50μl的微量點樣器吸取樣品20μl,將點樣器的針頭小心插入到點樣孔底部,慢慢注入樣品,要注意防止漂樣。

⑥電泳

點樣完畢后,連接好導線(正負電極不要接反,紅色為正極,黑色為負極),將電壓調至70 V,當溴酚藍標志線移至濃縮膠與分離膠分界處,將電壓調至150V,電泳2-3小時,當溴酚藍標志線剛好跑出膠板時,結束電泳。

⑦取膠

切斷電源,取出緩沖液并低溫保存,可重復使用2次。然后松開卡板，取出凝膠板,用解剖刀扁平部分插入玻板的一角(是分離膠的一角),輕輕撬去一塊玻板,用刀切掉分離膠右下角以示點樣順序,輕輕撬起分離膠,使之滾入染色培養皿中。

⑧染色

APX染色步驟如下：先用自來水溶液潤洗兩遍,再加入30-40ml的染色液,室溫下放置5-20min,至顯色完全。

⑨清洗玻璃板、膠皮、電泳槽。

五、注意事項

a、在整個清洗過程中要輕拿輕放，以免將玻璃板弄碎。同時，清洗玻璃板不容許用強酸、強堿以及酒精溶液，一般用清水加一點洗滌劑進行清洗，然后用除離子水或蒸餾水潤洗。

b.在整個實驗過程中，要注意實驗安全，凝膠、聯苯胺等試劑有毒，應戴乳膠手套或一次性手套操作。

c．在電泳過程中不允許用手去觸摸電極緩沖液，以免觸電。