瓊脂糖凝膠電泳常見問題與解決辦法
一、凝膠制備
1. 微波爐溶解瓊脂糖時,膠液沸騰沖溢出三角錐瓶微波爐加熱時膠液可能發生劇烈沸騰,
(1)總液體量不宜超過三角錐瓶的50%容量。
(2)2%以上膠液設置中火加熱。
(3)膠液劇烈沸騰時,停止加熱,移開三角錐瓶,請戴上防熱手套,小心搖動三角錐瓶,然后再次加熱,膠液沸騰直至膠液清澈,保證瓊脂糖完全溶解。
2. 瓊脂糖電泳圖像背景模糊不清:瓊脂糖沒有完全溶解會造成電泳圖像背景模糊不清。完全溶解的瓊脂糖膠液清澈,三角錐瓶內壁應沒有粘附瓊脂糖顆粒。
3.加熱后水分蒸發,如需要應加入熱的蒸餾水,補足到原來的重量,搖勻。
二、電泳
1. DNA條帶模糊,拖尾。
(1)DNA降解。避免核酸酶污染。
(2)DNA上樣量過多。減少凝膠中DNA上樣量。
(3)電泳緩沖液陳舊:電泳緩沖液多次使用后,離子強度降低,pH值上升,緩沖能力減弱,從而影響電泳效果。建議經常更換電泳緩沖液。
(4)電泳條件不合適。電泳時電壓不應超過20 V/cm,溫度<30℃,巨大DNA鏈,溫度應<15℃,核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。
(5)DNA樣含鹽過高。泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。
(6)有蛋白污染。電泳前抽提去除蛋白。
(7)DNA變性。電泳前勿加熱,用20 mM NaCl緩沖液稀釋DNA。
2. DNA條帶淡弱或無DNA帶。
(1)DNA的上樣量不夠:增加DNA的上樣量。
(2)DNA降解:避免DNA的核酸酶污染。
(3)DNA走出凝膠:縮短電泳時間,降低電壓,增強凝膠濃度。
(4)分子大小相近的DNA帶不易分辨。增加電泳時間,使用正確的凝膠濃度。
(5)DNA變性:電泳前請勿高溫加熱DNA鏈,用20 mM NaCl Buffer稀釋DNA。
(6)DNA鏈巨大,常規凝膠電泳不合適。在脈沖凝膠電泳上分析。
3. DNAMARKER條帶扭曲。
(1)配制凝膠的緩沖液和電泳緩沖液不是同時配制的。使用同時配制的緩沖液。電泳時緩沖液高過液面1~2 mm即可。
(2)電泳時電壓過高。可以在電泳前15分鐘用較低電壓(3 V/cm),等條帶出孔后,再調電壓。
(3)盡量慢慢加樣,等樣品自然沉降后再加電壓。