蛋白表達技術全攻略

一、材料與儀器

30%丙烯酰胺溶液;1.5mol/L Tris-HCl分離膠緩沖液，PH8.8;1.0mol/L Tris-HCl濃縮膠緩沖液，PH6.8;電泳緩沖液，PH8.3;10%SDS溶液;10%過硫酸銨溶液;樣品處理液;染色液;脫色液;電泳玻璃板，電泳電源架，電泳槽，電泳儀 等;蛋白Mark。

二、方法與步驟

1) 分離膠和濃縮膠配制

按下表比例分別配制分離膠和濃縮膠：

表2-7：聚丙烯酰胺 組成

2)凝膠板的準備

a) 洗板：

將洗潔精用溫水稀釋后，用它浸透海綿擦洗二塊玻璃板，然后用自來水洗凈，再用酒精將板擦干。

b)配板：

將二塊玻璃板疊放整齊，用夾子兩邊夾好，下沿兩邊角可用凡士林封住縫隙，將這二塊玻璃板固定在底座上。插入配套梳子，在梳子下緣劃線，指示灌膠位置。拔去梳子。

3) 灌膠

a)分離膠：

在分離膠的配置燒杯中按表2-7加料，混勻后利用滴管將分離膠(避免氣泡產生)滴入二塊玻璃板之間，至液面達到梳子下緣1cm處。用滴管緩慢加入水，注意不要沖亂膠面。靜置，待分離膠聚合后，倒去或用濾紙吸去水層。

b) 濃縮膠：

在濃縮膠的配置燒杯中按配比加料，混勻后即刻用滴管加濃縮膠(避免氣泡產生)覆于二塊玻璃板之間的分離膠之上至滿，輕輕插入梳子。靜置待其凝結后，即制成凝膠板。用筆在梳子形成的凝膠凹口部位作好記號，指示樣品點入時位置。

4)樣品處理

取樣：2ml(2管，1ml / 管)

a)工程菌：誘導前培養2.5h 每瓶加入180μl的IPTG誘導劑，誘導培養2h 取樣：2ml(2管，1ml / 管)

b)樣品6000轉離心10 min，收獲包含體

c)完全倒干，誘導前樣品：一管中加入30μl雙蒸水，打散后加入另一管中，打散;

d) 誘導后樣品：一管中加入50μl雙蒸水，打散后加入另一管中，打散

e)等體積加loading buffer：誘導前加30μl , 誘導后加50μl

f)沸水浴10 min，煮完后以15000轉離心10 min，取上清液走電泳

g)對照菌同樣操作

h)樣品及mark和loading buffer都各取15μl點樣，點樣順序按;對照菌誘導后、對照菌誘導前、工程菌誘導前、工程菌誘導后，一起走電泳的兩組間點mark，最右邊的泳道點loading buffer，走SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳

1) 電泳

a) 將二塊玻璃板制成的凝膠板上的夾子卸去，擦掉下沿兩邊角的凡士林。

b) 將凝膠板垂直靠在電泳槽里的電源架上，使凝膠板的凹沿面靠向電源架。通常兩塊凝膠板共用一個電源架。

c) 將凝膠板與電源架按要求固定于電源槽內。按要求加入電泳緩沖液，使分別加入在兩塊凝膠板中間電源架內的電泳緩沖液與加入在電泳槽中的電泳緩沖液互不相通。輕輕地拔去凝膠板內的梳子。

d) 取處理后的樣品液，用微量進樣器吸取適量樣品液，將樣品液緩緩加入凝膠板內地凹口部位(樣品點入處)。注意不要沖散樣品。

e)用二根導線連接電泳槽與電泳儀，注意紅色與黑色電極的插頭和插口相配。接通電源。控制電壓在濃縮膠中為70—80V，這次實驗我們控制在75V，走過濃縮膠后電壓調為120V。電泳時觀察凝膠板上的樣品溴酚藍的色條帶走至近底端1cm 時，停止電泳。關閉電源。然后從電泳槽內小心取出凝膠板。

2) 染色

a) 用刀片或薄板將凝膠板外的兩塊玻璃板輕輕撬開，使凝膠傾伏在其中一塊玻璃板上。

b) 用刀片在凝膠上沿分離膠與濃縮膠的交接處，將分離膠切下，并在分離膠的左上角切掉一小角，以標記樣品順序。

c)然后將分離膠小心移入染色器皿中。

d)在染色器皿中加入100 ml染色液，加蓋，染色3小時。

3)脫色

將染色液倒去。染色的凝膠用水漂洗數遍，瀝干水后置于染色皿中，再加入100 ml脫色液，加蓋，脫色至染色的凝膠經脫色后能清晰顯示出蛋白條帶止。