等電聚焦電泳與瓊脂糖電泳過程中凝膠板的制備方法和簡單操作

等電聚焦電泳 １.制備凝膠板 1)30%凝膠母液的制備 丙烯酰胺30克，N、N雙甲叉丙烯酰胺0.8克，加蒸餾水至100毫升，溶解后過濾,貯存于有色瓶內． 2)準備制膠模具 準備玻璃板涼快，相應壓條三根．同樣大小的玻璃紙及聚碳酸脂薄膜各一張（也可不用）．文具夾若干．上述用品洗凈晾干后備用． 先將玻璃紙用蒸餾水浸透，平放在一塊玻璃上，放三根壓條于其上（這樣就形成一個膠室），再放聚碳酸脂薄膜，最后放一張玻璃板，放壓條的地方用文具夾夾緊，兩塊大約錯開一公分，以備由此處灌膠． ３）聚丙烯酰胺凝膠板的制備 　　　取30%凝膠母液3.2毫升，依次加50%分析純甘油3.6毫升,雙蒸餾水10毫升，40%載體兩性電解質0.72毫升，10%過硫酸胺0.1毫升，（最好用時配制，或在制備一周內使用），充分混合后，從框墊開口處注入玻璃板夾層內的玻璃紙和聚碳酸脂薄膜之間的空間內，室溫放置1小時左右，去掉文具夾及聚碳酸脂薄膜及其上的玻璃板，既為聚丙烯酰胺凝膠板． 4)打開低溫循環器開關使水溫降至4℃左右． ２.加樣 　　　用1*0.5(或0.6*0.5)厘米濾紙片在0.1-0.5%濃度的樣品液中浸潤，貼于凝膠板1.5-2厘米處，與凝剿班的方向平行，每個樣品濾紙片間隔0.5厘米． ３.電泳 1）放置電級紙條，以3-4層寬0.6-1.0厘米、長10厘米的干濾紙條以1mol/L氫氧化鈉置于凝膠板陰級側的邊緣，同樣的濾紙條浸以1mol/L磷酸置于陽極側的邊緣． 2)將鉑金絲電極板放于凝膠板上，使連接電源陽極和陰極的電極絲分別壓在陽極側和陰極側的電極濾紙條上，最后蓋好電泳槽蓋． 3)接通電源開關，按下＂預置＂開關鍵，預置電壓、電流及功率的參考值分別為2500V、50mA、功率80W．然后按下開關鍵，電源即有輸出，電泳開始．一般選擇穩壓或穩功率，電泳時間1-1.5小時． 4.固定 　　電泳結束后，凝膠板以12.5%三氯醋酸固定20分鐘． 5.染色 　　取0.4克考馬斯亮藍R250加入120毫升甲醇液中20克三氯醋酸，12克磺基水楊酸，蒸餾水400毫升，制成考馬斯亮藍染色液，將經固定的凝膠板放置于染色液中，60℃水浴中染色30分鐘．　 6.脫色 　　乙醇、冰醋酸及蒸餾水按1:3:6的比列緩和即為脫色液．將染色后的凝膠板放置于該脫色液中，室溫下脫色24－43小時． 7.繪PH曲線（此步驟需在電泳結束后，固定之前進行），測等電點． 8.照相 凝膠板干燥處理后保存或照相后保留底片．

瓊脂糖電泳 1.先用膠條封住凝膠托盤兩端，然后放在水平臺上．把試樣格固定在試樣格架上，放在凝膠托盤合適的位置上．把配置好的瓊脂糖凝膠倒如槽中（主義瓊脂糖凝膠的溫度不要超過60℃）．待凝膠聚合后，輕輕拔掉試樣格． 2.在電泳槽兩端活動槽中加上緩沖液，把凝膠托盤兩端的膠條撕掉并移到電泳槽中． 3.用與凝膠等同寬度的四層濾紙約20mm長，并折成直角；濾紙的一端搭在凝膠板上，另一端浸在緩沖液中． 4.點樣． 5.插上電源線，接同電源開始電泳． 6.主義不要接錯正負極，檢查無誤后打開電泳儀電源開關．根據凝膠板的薄厚選擇適宜的電壓與電流即可電泳． 7.電泳實驗結束后，先關閉電泳儀電源開關；隨之打開電泳槽取出凝膠托盤． 8.觀察和照相：在254nm或300nm紫外燈下觀察，或用135照相機加橙色濾光片在紫外分析儀上照相．

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