雙向電泳的實驗相關試劑配制

1．? ? ? ? Bradford 工作液 95%乙醇? ?? ?? ?? ? 25ml? ?? ? 先用乙醇溶解考馬斯亮蘭G250，溶解完后再加磷 85%磷酸? ?? ?? ?? ? 52ml? ?? ? 酸，最后超純水定容至500ml。過濾后置于棕色瓶 考馬斯亮蘭G250? ?? ?0.035g? ???外加油皮紙保存（Bradford不穩定，一周內有效） 2．? ? ? ? 裂解液 尿素? ?? ?? ?? ?? ???8M 硫脲? ?? ?? ?? ?? ???2M CHAPS? ?? ?? ?? ?? ?4% DTT? ?? ?? ?? ?? ???60 mM Tris―base? ?? ?? ?? ?40 mM（如果有條件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate） 3.? ? ? ? 水化液儲液 尿素? ?? ?? ?? ?? ???8M 硫脲? ?? ?? ?? ?? ???2M CHAPS? ?? ?? ?? ?? ?4% Tris―base? ?? ?? ?? ?40 mM 4.? ? ? ? 分離膠buffer (pH8.8)? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 250ml SDS? ?? ?? ?? ?? ?? ?0.4%? ?? ?? ?? ?? ?? ? 1g Tris―HCl? ?? ?? ?? ? 1.5M? ?? ?? ?? ?? ???45.4275g 5.? ? ? ? 濃縮膠buffer (pH6.8)? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 100ml SDS? ?? ?? ?? ?? ?? ?0.4%? ?? ?? ?? ?? ?? ?0.4g Tris―HCl? ?? ?? ?? ? 0.5M? ?? ?? ?? ?? ?? ?6.07g 6.? ? ? ? 凝膠儲存液（30%的丙烯酰胺）? ?? ?? ?? ?? ?250ml Acr? ?? ?? ?? ?? ?? ?29.2%? ?? ?? ?? ?? ?? ?73g Bis? ?? ?? ?? ?? ?? ? 0.8%? ?? ?? ?? ?? ?? ? 2g 7.? ? ? ? 電極緩沖液（跑一次要配制2500ml） 甘氨酸? ?? ?? ?? ?? ?43.2g? ?? ?? ?? ?? ?? ?36g Tris? ?? ?? ?? ?? ?? ?9g? ?? ?? ?或? ?? ?? ???7.5g SDS? ?? ?? ?? ?? ???3g? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?2.5g? ?? ?? ?? ?? ? 超純水定容至3000ml? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 超純水定容至2500ml 8．? ? ? ? 0.5M Tris ―HCl pH 6.8儲液 6.1g Tris先用30ml超純水溶解，再用46ml，3M HCl調pH6.8,再加水定容至100ml 9．? ? ? ? 平衡液儲液 脲（即尿素）? ?? ?? ?36g 甘油? ?? ?? ?? ?? ???30%? ?? ?? ?? ?? ?? ?30ml SDS? ?? ?? ?? ?? ?? ?1%? ?? ?? ?? ?? ?? ? 1g 0.5M Tris―HCl pH6.8??10ml? ?? ?? ?? ???超純水定容至100ml 10. 平衡液A（一根膠條） DTT? ?? ?? ?? ?? ???20mg 平衡液儲液? ?? ?? ???10ml 11．平衡液B（一根膠條） 碘乙酰氨? ?? ?? ?? ? 300mg 平衡液儲液? ?? ?? ???10ml 0.05%溴酚蘭? ?? ?? ? 15ul? ?? ?? ?? ???(平衡液A、B均需臨時配制) 12．0.5%瓊脂糖10ml 瓊脂糖? ?? ?? ?? ?? ?0.05g 電極緩沖液? ?? ?? ???10ml 溴酚蘭? ?? ?? ?? ?? ?25ul 補：4、5、6的溶液需過濾后儲存于4OC備用。 C．? ? ? ? 藥品 CHAPS? ?? ?? ? 兼性離子去垢劑? ? 去垢劑可破壞蛋白質分子之間的疏水相互作用， SDS? ?? ?? ?? ?離子型去垢劑? ?? ? 提高蛋白質的溶解性，防止在等電聚焦時析出 尿素? ?? ?? ?? ?離液劑? ?? ?? ?? ? 可改變或破壞氫鍵等次級鍵的結構，使蛋白質 硫脲? ?? ?? ?? ?離液劑? ?? ?? ?? ? 變性并使蛋白失活。尿素和硫脲聯合使用，可 ? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ???以大大增加蛋白質的溶解性 DTT? ?? ?? ?? ?還原劑? ?? ?? ?? ? 斷裂蛋白質分子中Cys殘基之間形成的二硫鍵，增加蛋白質的溶解性。但過分提高DTT的濃度，由于它pKa在8左右，因而會影響pH梯度。DTT在堿性pH下會去質子化，等電聚焦時會損耗，導致二硫鍵復原，蛋白質沉淀 BSA? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? Bradford中制作標準曲線用 無水乙醇? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?和磷酸一起，提供Bradford中的環境 磷酸? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 提供Bradford中的酸性環境 Tris? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ???構成緩沖液的成分，可用于抗衡pH的變化 IPG buffer 覆蓋液? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ???即礦物油，防止水分蒸發，樣品干燥。 丙烯酰胺（Acr）? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?以丙烯酰胺為單體，甲叉二丙烯酰胺為交聯劑， 甲叉二丙烯酰胺 （Bis）? ?? ?? ?? ???在催化劑（Aps）和引發劑（TEMED）作用下，聚合交聯成三維網狀結構 瓊脂糖 溴酚蘭? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 指示劑作用 碘乙酰氨（IAA）? ?? ?? ?? ?? ?? ? 平衡液B中使用，中和A液中的DTT 正丁醇? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ???比聚丙烯酰胺密度小，用于凝膠制作過程中的壓膠 甘油? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? 無機鹽的良好溶劑，熱穩定性好 Marker 考馬斯亮蘭G250（Bradford法用）? ? 考馬斯亮蘭G250有紅、藍兩種不同顏色的形式在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，當與蛋白結合后，產生藍色化合物，反應迅速而穩定，反應化合物在465~595nm處有最大的光吸收值，化合物顏色 深淺與蛋白濃度的高低成正比關系，因此可檢測595nm的光吸收值的大小計算蛋白的含量 甘氨酸? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ???與Tris構成緩沖系統 AgNO3 EDTA? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?金屬螯合劑，可以結合銀離子，終止銀染過程