高效毛細管電泳法測定羥基喜樹堿及其相關物質的含量

摘要：目的建立一種用高效毛細管電泳法測定羥基喜樹堿及其相關物質的舍量的方法。方法以35mmol/L 的硼砂溶液(pH 7.5)作為運行緩沖液；未涂縣熔融石英毛細管柱為57cm×μ75m徂，有效長度為50cm；進樣壓力為.5psi，進樣時間為3s；運行電壓為18kV；分離溫度為20℃：檢測波長為254nrno以拓撲替康為內標。測定羥基喜樹稿．。結果所確定的實驗條件可使羥基喜樹堿與其相關物質得到令人滿意的分離。結論本方法簡單、高效，可有效地控制羥基善樹堿的質量。

關鍵詞：高效毛細管電泳法 羥基喜樹堿 相關物質

    羥基喜樹堿(Hydr0xycampt0thecin)是我國特有的珙桐科喬木—喜樹種子中分離提取的一種微量生物堿，系目前從喜樹中得到的20多個單體中抗癌作用最強的化合物。本品抗癌機制與其它抗腫瘤藥不同，系通過選擇性的抑制拓撲異構酶I(Topp1)，干擾DNA的復制，促使癌細胞的死亡，從而達到抗癌的目的。其具有高效、低毒、廣譜抗癌的特 ，在臨床上用于膀胱癌、直腸癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、白血病及頭頸部腫瘤等的治療田。喜樹堿(camptothecin)與羥基喜樹堿的差別就在于1O位碳上連接的是氫而非羥基，它是羥基喜樹堿的相關物質，其毒性較羥基喜樹堿的大。羥基喜樹堿原料及其制劑含量測定方法通常為紫外分光光度法日。該法專屬性不強，含量測定結果常常偏高。為此，人們相繼用高效液相色譜法、高效毛細管區帶電泳法測定其含量，使其質量得到了有效地控制。本文以10-羥基_9一二甲氨基亞甲基喜樹堿為內標，用高效毛細管電泳法測定羥基喜樹堿及其相關物質的含量。

1 儀器與試藥
1．1 儀器：美國Beckman P／ACE 5010型毛細管電泳儀、固定波長紫外檢測器及P／ACE數據工作站；河北永年光導纖維廠未涂漬的熔融石英毛細管，57cmx75μm i．d，有效長度為50cm；日本SIBATA SU－－6THE超聲波清洗器。
1．2 試劑和藥品：羥基喜樹堿和喜樹堿對照品均由中科院上海藥物研究所提供，鹽酸拓撲替康對照品由重慶潤康藥業有限公司提供；羥基喜樹堿原料藥(01批、02批和O3批)及其粗品由某藥廠提供；所用試劑均為國產分析純試劑；試驗用水為三蒸水。

2 實驗方法
2．1 溶液的配制
2．1．1 對照品貯備液的配制：精密稱取羥基喜樹堿對照品適量，用甲醇溶解并制成均含25mg/L 的溶液，作為對照品貯備液。
2．1．2 內標貯備液的配制：精密稱取鹽酸拓撲替康對照品適量，用甲醇溶解并制成含25mg/L的溶液，作為內標貯備液。
2．1．3 供試品溶液的配制
2．13．1 測定含量用：精密稱取羥基喜樹堿原料藥適量，用甲醇溶解并制成含25mg/L的溶液，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加內標貯備液5．0ml，加甲醇至刻度，搖勻，作為測定含量用的供試品溶液。
2．1．3．2 測定有關物質用：精密稱取羥基喜樹堿原料藥(粗品)適量，用甲醇溶解并制成含100mg/L的溶液，精密量取5ml，置25ml量瓶中，加甲醇至亥0度，搖勻，作為測定有關物質用的供試品溶液。
2．2 電泳條件：以35mmol/L的硼砂水溶液(用稀鹽酸調節pH值至7.5)作為運行緩沖液；運行電壓為18kV；檢測波長為254nm；工作溫度為20℃；進樣壓力為0.5psi ，進樣時間為3s,每次開機后，依次用lmol/L氫氧化鈉溶液及水沖洗毛細管2min，2次進樣之間均用緩沖液清洗毛細管2min，以獲得更好的重現性。上述各個溶液在使用前均需經0．45μm微孔濾膜濾過并超聲脫氣。

3 實驗方法的驗證與結果
3．1 線性關系和靈敏度
3．1．1 線性試驗：精密量取對照品貯備液lml、2ml、3ml、5ml、10ml和15ml，分別置25ml量瓶中，各加內標貯備液5．0ml，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，依2．2項下的電泳條件進行測定。以羥基喜樹堿與鹽酸拓撲替康峰面積之比為縱坐標標(Y)，羥基喜樹堿的濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線，經回歸分析，得線l生方程為：Y=1．1 83X+1．43x10-2．r=0．9991。結果表明，在1-15lμg/ml 范圍內，羥基喜樹堿與鹽酸拓撲替康峰面積之比和羥基喜樹堿濃度呈現良好的線性關系。
3．1．2 靈敏度試驗：精密量取對照品貯備液lml，用甲醇稀釋成與信噪比為3時的電泳譜峰相應的含羥基喜樹堿濃度之溶液。結果表明，最低檢出濃度為0．5 μg/ml 。
3．2 精密度和穩定性
3．2．1 精密度試驗：分別精密量取濃度為25 mg/ml的供試品溶液2m]、5m]、lOml，分別置25ml量瓶中，各加內標貯備液5．0ml，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。依3．1．1項下的方法制備標準曲線，再依2．2項下的電泳條件進行測定，將測得的供試液與內標液峰面積之比代人標準曲線求得供試液的實際含量 同一濃度的被測溶液每天測定5次，共測定5天得到如表1所示的結果。
3．2．2 穩定性試驗：精密量取精密度試驗用的濃度為5μg/ml 的供試液，在避光、室溫條件下放置0、1、3,5、8h后依法進行測定。結果表明，本溶液在5h內穩定測得濃度為4．892±0．02531μg/ml,RSD為2．68％。
33 回收率實驗：精密量取濃度為25mg/ml的供試品溶液2ml，置25ml量瓶中，加內標貯備液5．0ml，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試液。依3．1．1項下的方法制備標準曲線，再依2．2項下的電泳條件測定上述供試液，將測得的供試液與內標液峰面積之比代人標準曲線求得供試液的實際含量。分別精密量取已測定含量的供試液2ml，置不同的25ml量瓶中，分別加內標貯備液5．0ml
和對照品貯備液2．0、5．0、10．0ml，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，依法測定，計算回收率。每個濃度分別測定3次。
3．4．1 粗品的測定結果：取由羥基喜樹堿粗品制得的測定有關物質用的供試品溶液，依2．2項下的電泳條件進行測定，適宜的調整檢測靈敏度，使有關物質峰均能顯現，記錄電泳譜圖至主成分峰保留時間的2倍。其典型HPCE圖譜見圖2。由該圖可見，本文建立的方法可使羥基喜樹堿與其相關物質達到基線分離。
3．4．2 有關物質的測定結果：取由羥基喜樹堿原料藥制得的測定有關物質用的供試品溶液，依2.2項下的電泳條件進行測定適宜的調整檢測靈敏度，使有關物質峰均能顯現，記錄電泳譜圖至主成分峰保留時間的2倍。按峰面積歸—化法計算有關物質的含量。

4 實驗方法的確定
4．1 檢測波長的確定：該儀器僅帶有200、214、254和280nm四個波長的濾光片。為了提高檢測靈敏度，本實驗選定檢測波長為214nm。實驗證明，在該波長處不干擾羥基喜樹堿及其相關物質的測定。
4．2 緩沖液的確定
4．2．1 緩沖液的組成：本實驗分別對碳酸鹽緩沖系統、硼酸鹽緩沖系統、磷酸鹽緩沖系統、磷酸鹽—硼酸鹽緩沖系統對羥基喜樹堿與其相關物質的分離效果進行了6研究。結果表明，碳酸鹽和磷酸鹽緩沖系統均不能達到預期的分離效果；硼酸鹽和磷酸鹽硼酸鹽緩沖系統在優化的條件下均可使羥基喜樹堿與其7種相關物質得到基線分離，但磷酸鹽硼酸鹽緩沖系統會使體系的電流增大，反映到電泳譜圖上就是使譜峰加寬，理論塔板數較小。因此，本實驗以硼酸鹽緩沖系統作為背景電解質。
4．2．2 緩沖液的濃度：實驗證明，緩沖液濃度在一定的范圍內(10-40mmol/l)對分離效果影響較大，提高濃度會使分離時間延長，有利于分離反映到電泳譜圖上就是使譜峰的個數增加。反之，則使分離效果降低，譜峰個數減少。進一步加大緩沖液的濃度會使焦耳熱增大，不利
于分離。經實驗，選定緩沖液的濃度為35 mmol/l 。
4．23 緩沖液的pH值：分離生物堿通常采用毛細管區帶電泳分離模式在合適的pH緩沖液條件下使生物堿在緩沖液中部分帶正電荷，并基于質荷比的不同而實現分離。為此，本實驗就pH4．0～9．5的緩沖系統對分離效果的影響進行了考察。結果表明，在酸I生pH值下，物質的遷移時間有延長、譜峰有展寬的趨勢；在較強堿l生條件下，電滲流加大，物質的遷移速度過陜，影響分離效果。經實驗，選定緩沖液的pH值為7.5。在該條件下，羥基喜樹堿與其相關物質可達到基線分離，且出現蝴普峰數目最多。
4．3 分離電壓的確定：在毛細管區帶電泳中，電壓升高，電滲遷移速度增大，組分遷移時間縮短。但如果電壓過高，就會產生過多的焦耳熱，使區帶展開顯著，降低柱效和分離效率，而目還易在毛細管內形成氣泡，使分離無法進行。故此，分離電壓的確定是非常重要的。經實驗，選分離電壓為18kV。在此條件下，分離效率較高，分析時間較短。
44 溶媒的確定：羥基喜樹堿難溶于水而微溶于甲醇等有機溶劑。另外，甲醇在該電泳體系中可起到改善峰形的作用。故此，選用甲醇作為溶解試樣的溶劑。
4．5 其他：羥基喜樹堿遇光易分解，在實驗過程中需避光。從穩定性實驗結果可知，隨著放置時間的增加，含量有下降的趨勢。因此，制備樣品和對照品溶液后應在5日內測定完畢。

5 小結
    本實驗應用毛細管區帶電泳對羥基喜樹堿原料藥進行測定，具有快速、分離效率高等特點，可用于該藥物的質量控制。

參考文獻
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