分析血清蛋白進行早期癌癥的診斷

表面放大激光解吸離子化（SELDI）是一種質譜的改進方法，用它能夠對復雜生物混合物如血清中癌癥特異性蛋白質進行檢測。本文示范使用SELDI方法找到了與乳腺、結腸、前列腺惡性疾病相關的血清蛋白。新術語“血清蛋白組”（Seroproteomics）描述了確定與特殊疾病相關的血清蛋白的過程。正在進行的工作試圖擴展包括與其他惡性、癌變之前以及良性條件相關的血清蛋白的分析，并且為了將其應用于常規臨床實驗室而優化了分析步驟。

Surface-enhanced laser desorption/ionization（SELDI）is an improved method of mass spectrometry that enables detection of cancer-specific proteins in complex biological mixtures such as serum. The use of SELDI to discover the serum proteins that are specifically associated with malignant disease of the breast, colon, and prostate has been demonstrated. The new term seroproteomics describes the process of identifying serum proteins associated with specific disease states. Studies are under way to extend the analysis of serum proteins to include additional malignant, premalignant, and benign conditions and optimize assay protocols fir routine use in clinical laboratories.

      為檢查早期癌癥，癌癥發生前的普檢能夠減少與癌癥相關和與治療相關的死亡率。盡管許多癌癥已經能夠治療，甚至在腫瘤未擴散之前如果能做出正確診斷，可以完全治愈，但實際上大部分癌癥患者直到已經開始危害到周圍組織或轉移到較遠的器官后才能檢測出來。例如，只有約50％的乳腺癌、56％的前列腺癌和35％直腸癌在診斷時能夠確定癌變位置^[1]。盡管已經有了一些常規的診斷方法，如診斷乳腺癌的胸部腫瘤X射線透視法、診斷前列腺癌的血清前列腺特異性抗原(PSA)和診斷結腸癌的大便潛血檢測，但在癌癥所導致的死亡中這3種癌癥僅次于肺癌^[2，3]。

　　與腫瘤相關的血清蛋白標記物的發展使一些癌癥的臨床診斷和治療更為簡便，但是對于幾種主要的癌癥進行有效診斷的生物標記物尚不盡如人意。只有用于膀骯癌的尿液NMP22^? (Matritech，Newton，MA)^[4]和血清PSA兩種生物標記物，對經選擇的人群的診斷和早期檢查來講有足夠的靈敏度。已被食品藥品管理局(FDA)批準的用于癌癥診斷的另外3種血清標記物分別是診斷肝細胞癌和睪丸癌的α-胎蛋白、檢查神經母細胞病的兒茶酚胺和檢查多重骨髓瘤的免疫球蛋^[4]。以這些蛋白的分析結果作為癌癥早期診斷的判據，靈敏度和特異性都不夠，只能作為其他直接檢驗和診斷方法的補充。此外，還有一些可以作為標記物用于臨床上監控治療與恢復的與腫瘤相關的血清蛋白，值得注意的有結腸癌的癌胚抗原(CEA)，晚期乳腺癌的HER-2／neu、CAl5-3、CA 27-29和卵巢癌的CAl25^[5-7]。新的與癌癥相關的血清蛋白種類的確定，高靈敏度和特異性分析方法的建立，將會擴展現有的對癌癥早期檢查和診斷的臨床處理能力，并進一步降低癌癥致死率。

　　二維聚丙烯酰胺硅膠電泳(2D-PAGE)是一種在癌癥早期鑒別腫瘤標記物的新方法。然而，這種方法不適于大規模的普查或臨床檢驗，因為它是一種費時、費力，而且在實驗室很難標準化的方法，無法將其作為大量樣品的常規分析方法。2D-PAGE的這些缺陷可以通過新發展的技術，如基質輔助激光解吸離子化?飛行時間質譜(MAIDI-TOF)加以克服。在MALDI-TOF分析中，復雜體系中的蛋白被黏附于固態的金屬基質上，然后用脈沖激光來解吸以產生氣態離子，并穿過飛行管。由于飛行速度與其質量有關，可根據飛行速度的差異進行分離。MALDI-TOF分析大蛋白質分子具有很高的靈敏度，并且非常適合于自動化分析，可以通過信息工具查找蛋白質和肋序數據庫識別個別的蛋白和肽^[8]。

　　表面放大激光解吸離子化(SELDl)TOF-MS的發展使得快速靈敏的蛋白質的識別和分析取得進一步的發展。SELDI是一種以親和力為基礎的質語法，蛋白質被選擇性地吸附到經化學改性的固體表面上，雜質可通過清洗除去^[9]。采用能量吸收基質，蛋白質通過激光解吸質譜分析進行識別。SELDI系統(Ciphergen Biosystems，Inc.，Frgmont，CA)已經商業化。它是基于在多樣品帶(multisample strips)上設定好的結合位置上排布陣列來進行工作的。這些ProteinChip ^?(Ciphergen Biosystems)陣列具有不同的化學修飾表面，蛋白通過親水、離子、疏水相互作用或形成金屬螯和物與表面鍵合，很多種類的蛋白質可以用一種相對簡單的分析策略來檢測。SELDI分析蛋白的方法被用于檢測復雜蛋白混合物中(例如細胞溶解物、血漿和精液)的與前列腺相關的生物標記物^[10]。可以直接對腫瘤組織的微小碎片中的與癌癥相關的蛋白質進行剖析^[11]。

　　膀骯腫瘤標記物(尿液NMP22)的定量酶免疫測定的檢測靈敏度僅次于通過尿細胞活動對膀骯癌的診斷^{[4，12，13]}。NMP22試劑盒已在美國、中國、日本和歐洲用于臨床診斷初期和復發膀骯癌。本文探討采用質譜分析血清中的乳腺癌、前列腺癌、結腸癌的腫瘤特異性標記物(Seroproteomics ^TM)(Matritech)。

1 實驗

1．1樣品來源

　　合作單位K． Marcinkowski 醫科大學(Poznan，Poland)提供了曾經患有早期乳腺癌、轉移性癌、原位乳腺癌(DCIS)或者良吐的乳房疾病的女性血清樣品，患有結腸癌、脈息肉、憨室炎及其他良性結腸疾病的病人的血清樣品以及未患息肉及癌癥的對照樣品也來自K．Marcinkowski醫科大學。The Johns Hopkins醫學院(Baltimore，MD)提供患有前列腺癌和正常男性血清樣品。所有樣品的收集都符合醫院的相應制度規定。血清樣品分析前在?80℃下保存。

1．2血清蛋白的SELDI檢測

　　先用l，1，2三氯-三氟乙烷除去人血清樣品中的油脂， 然后通過HiTrap Protein G 柱(Ame rsham Prlarmacia Biotecn，Piscataway，NJ)除去免疫球蛋白，最后通過一個HiTrap Blue柱(Amersham Pharmada Biotech)除去人血清白蛋白(HSA)。乳腺癌和結腸癌樣品與對照樣品用HiTrap Q離子交換樹脂(Amersham Pharmacia Biotech)作固定相，采用NaCl梯度洗脫。前列腺癌樣品和對照樣品采用Protein Pak Q 8 HR柱(Waters Corp.，Milford，MA)，用NaCl梯度洗脫。把所得餾分轉移到分析緩沖液(50mmol／L NaH₂PO₄，pH 7．0)中。濃縮后根據廠家提供的ProteinChip說明書中的方法分析，圖l給出了樣品處理過程的流程。

　　樣品用PBS-I系列P rotein Chip系統(Ciphergen)按照制造商的推薦操作流程進行分析。Ciphergen系統軟件被用來比較樣品中的蛋白質譜圖，以識別僅存在于癌癥樣品中而在對照樣品中不存在的蛋白質。

1．3識別與癌癥相關的血清蛋白的策略

　　癌癥特異性蛋白標記物通過3步的判斷策略識別。第1步：將5個曾診斷出患腫瘤的病人的血清與5個正常人的對照血清樣品相比較，每個血清樣品都可以用離子交換色譜分離出12個餾分(結腸或乳腺癌)或14個餾分(前列腺癌)。每個餾分再用5種不同的ProteinChip分析：H4對于反相鍵合來說具有疏水表面；WCX2可以鍵合帶陽離子的蛋白質；SAX2鍵合陰離子蛋白；IMAC-Cu²⁺鍵合與Cu²⁺親和的蛋白質；IMAC-Ni²⁺與和Ni²⁺親和的蛋白結合。樣品用SELDI ProteinChip分析，檢測可能與癌癥相關的只存在于癌癥樣品中的相應蛋白質峰。

　　第2步。另外15個癌癥樣品和15個對照樣品在特殊條件下進行分析(單個離子交換所得餾分用單個ProteinChip分析)。以此來確定每個假設與癌癥相關的峰。如果某種蛋白在所有20個癌癥樣品中都存在，而在任何一個對照樣品中都不存在，則可以將其確認為“癌癥相關蛋白”。

　　第3步，選取一種或兩種癌癥相關蛋白進行進一步研究。血清樣品系列范圍擴展到包括不同時期的惡性腫瘤或不同種類的良性疾病。新的血清樣品用前述方法處理，把每個樣品的離子交換色譜餾分用到一種蛋白芯片中，根據檢測選定蛋白的特定條件，確定癌癥相關蛋白是否存在于每個樣品中。

2 結果與討論

2．1與乳腺癌相關的血清標記物

　　通過對5個惡性乳腺癌樣品和5個健康的對照樣品進行血清蛋白分析，已發現幾種僅存在于每個癌癥樣品中而在對照樣品中不存在的蛋白。為了進一步研究，從這些蛋白中選出一種??28．3kD蛋白，它是用50mmol／L NaCl進行離子交換所得餾分中的IMAC-Ni²⁺ ProteinChip來識別的(圖2)。對另外15個乳腺癌病人血清和15個對照血清進行分析，證實28．3kD蛋白只在癌癥樣品中存在。

　　將樣品數量擴大到包括26個轉移乳腺癌樣品、15個早期癌癥樣品(即腋下淋巴結沒有發生變化或者已擴散到一個甚至多個淋巴結的病例)、5例DCIS、5例良性乳腺疾病以及23個正常對照樣品。28．3kD蛋白正確地識別了41／41(100％)的轉移、晚期和早期癌癥，并且排除了27／28(96%)的非惡性對照樣品(表1)。我們稱這種蛋白為NMP66，選取它進行進一步研究，并為公認的乳癌診斷標記物。

　　NMP66能檢測4／5(80％)的DCIS。 DCIS本身是一種非擴散性的惡性腫瘤，但它能夠發展為擴散性的癌癥。DCIS的癥狀通常不太明顯，它的確診率隨著乳房X線透視的廣泛使用而上升，現在所有的乳房惡性疾病中DCIS占1／3。DCIS有不同的種類，其中25％?50％可以通過手術治愈，或者用放射治療和用三苯氧胺來減輕癥狀^[1]。臨床實驗正在致力于找到DCIS的先兆標記物來協助選擇治療方案。盡管這里提到的特異性癌癥標己物NMP66被評價作為前期癥狀的診斷，但并不能作為預見性的診斷。由于非擴散性腫瘤可以采用不切除乳房的治療辦法，因此對識別非擴散性的DICS的血清蛋白仍具有很高州臨床價值。

　　乳房X線透視是一種無害的在臨床上非常有效的常用診斷方法，主要用于腫瘤明顯并且在有臨床癥狀產生之前檢測早期乳腺癌。早期治療可以減少40?79歲婦女的癌癥死亡率和臨床發病率^[1-3]。乳房X線透視的靈敏性(某個患癌癥的人檢驗結果有呈附性的可能)和專一性(某個未患癌癥的人檢驗結果有呈陰性的可能)隨患者年齡的增加而增加。多項研究的綜合結果為：對于40?49歲的婦女，靈敏性為41％；超過50歲的婦女靈敏性為61％?74％之間；65歲以上的婦女靈敏性大于81%^[1]。目前，只有一半左右符合條件的婦女接受一年一度的乳房X射線檢查，血清蛋白標記物例如NMP66，對于惡性腫瘤的有效檢測可以提高乳腺癌普查的診斷率。也將使更多的人可能接受普查。

2．2血清標記物檢查結腸癌

　　以上提過的質譜法也可用于識別結腸癌血清蛋白標記物。對51個患良性、惡性或未轉變為思性的結腸疾病病人的血清與20個健康人對照樣品進行了比較，結果在所有患結腸癌或患有可能發生癌變的息肉病人血清中都發現了13．8 kD蛋白，而在未患癌癥的對照樣或者是患有其他良性腸道疾病(如節段性回腸炎或潰瘍性結腸炎)的血清中卻未檢出。這種蛋白可以采用SAX2 Protein-Chip檢測。有趣的是，這種蛋白會在患腸西憩室病的病人體內檢出(表2)，而腸憩室病并沒有轉成惡性腫瘤的危險性。

2．3前列腺癌血清標記物

　　采用同樣的方法來確認前列腺癌血清蛋白標記物，用WCX2 ProteinChip發現了存在于所有36個以前確診患有前列腺癌的男性血清中的50．8kD蛋白，而它在20個健康的對照樣中卻全都不存在(表3)，但其中有8個男性病人用這種50．8kD血清蛋白檢查確認患有癌癥，而用PSA做血清測試則未查出。PSA是用來檢查男性前列腺癌的一種常規血液標記物，其檢出的平均靈敏性為70%，但陰性反應的預見值僅為25％?30%^[14，15]，很大一部分是假PB，性。盡管PSA診斷法己被廣泛接受，但仍然沒有可靠的研究結果表明它的使用降低了癌癥的死亡率^[l，3]。已有人^[10]開始用SELDI來分析確診患有前列腺癌的男性病人的腫瘤細胞溶解液、血清和精液，檢測其中與PSA、前列腺特異性蛋白、前列腺磷酸酯酶或前列腺特異性膜抗原(除此之外還有幾種較小的未確定蛋白)相同分子質量的蛋白，但是所分析的樣品數量較少。

3 結論

　　SELDI是一種質譜的改進方法，它能夠對復雜生物混合物如血清(經處理除去血清主要干擾成分)中癌癥特異性蛋白進行檢測。本文用SELDI法找到了與乳腺、結腸、前列腺惡性疾病對應的相關血清蛋白。我們用“血清蛋白組”(Seroproteomics)這個詞來描述確定與特殊疾病相關的血清蛋白的過程，現在正在進行的工作包括這3種蛋白的進一步確定，并將分析范圍擴展到惡性、癌變之前、良性條件下的病變，以及優化分析步驟，以用于常規臨床實驗室。其他的質譜分析方法。如MALDI-TOF對發展低成本、高產出的化驗方法也是有用的。這些腫瘤特異性血清蛋白可能會對建立一種新的損害小、靈敏、特異性癌癥早期癥狀發生前的檢測很有幫助。

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