離子阱質譜在蛋白組學中的應用

質譜(MS)是識別蛋白及其特性的重要手段。許多蛋白質研究人員，特別是具有生物學背景的人，對于基質輔助激光解吸離子化-飛行時間質譜(MALDI-TOF)技術和二維凝膠(2-D gel)電泳聯用是十分熟悉的。研究表明，HPLC與離子阱串聯質譜(LC-MS-MS)聯用能夠高效的分離蛋白質與肽，該體系對于識別蛋白質及表征翻譯后修飾十分有用。

Mass spectrometry (MS) plays a key role in protein identification and characterization. Many protein researchers,especially those with biology backgrounds, are more familiar with the use of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) instruments in combination with 2-D gel electrophoresis. Research experience, however, indicates that HPLC coupled with tandem ion trap MS (LC-MS-MS) permits the highly efficient separation of proteins and peptides.moreover, this hyphenated system is particularly useful in protein identification and for characterizing posttranslational modification.

      現在人類基因組計劃已經告一段落，研究人員開始將研究重點集中到蛋白組學上。蛋白組學是研究生物體中蛋白質的表達、相互作用以及修飾的科學。了解蛋白質的特征能夠使得人們更加有效和系統地開發及確定新的藥物靶標，并且能夠加速新的診斷方法及治療藥物的發展。

　　質譜是識別蛋白及其特性的重要手段。基質輔助激光解吸離子化?飛行時間質譜(MALDI。TOF)技術和二維凝膠(2-D gel)電泳聯用對許多研究蛋白的科學人員，特別是生物領域的研究者具有非常大的吸引力。研究結果表明，高效液相色譜與離子阱串聯質譜(LC-MS-MS)聯用能夠高效地分析蛋白質和多肽，并且特別有利于蛋白質的識別及其翻譯后修飾的表征。

　　離子阱質譜非常有利于蛋白組學的研究。它能夠有效地收集離子和提供大量的碎片信息以及特別適合蛋白質階快速測序。

　　蛋白質的快速識別和表征是非常重要的。蛋白組的研究比人類基因組的研究困難大得多，人類基因組有30000?40000個基因，而人體中所含有的蛋白質的數目約有300000種或者更多。這意味著研究者需要一種比gel／MALDI-TOF方法更加快速的技術來進行蛋白質的識別。

1 利用離子阱LC-MS-MS技術的兩個實例

　　下面列出兩例來說明離子阱LC-MS-MS技術的優點。第一例是，Thermo Finnigan公司(San Jose，CA)的研究人員最近利用LC Surveyor^TM HPLC、LCQ ^TM Deca離子阱質譜和TurboSEQUEST^?軟件(均由Thermo Finnigan公司提供[如圖1])測定了Hep-G2(human liver hepatoblastoma)細胞分泌的蛋白質。在5h內以較高的置信度識別了95種蛋白質。

　　為了進行比較，研究人員在網上www．expasy．ch／cgi-bin／map2／def?HEPG2SP HUMAN站點發現丁關于Hep-G2(human liver hepatoblastoma)細胞中蛋白質識別的研究報告。這篇報告是利用傳統的二維凝膠電泳和許多分析技術聯用。雖然總的實驗時間沒有列出，但熟悉二維凝膠電泳的人都知道，二維凝膠電泳分離這些蛋白質的時間總要超過5h。這篇研究報告顯示僅有25種蛋白質被識別，而Thermo Finnigan研究人員的識別數目幾乎是它的4倍。

　　第二例是最近完成的酵母蛋白組的大規模分析。Michael P．Washburn，Dirk Wolters和John R．Yates Ⅲ組織了這個研究。Washburn博士和Wolters博士工作于Syngenta公司的Torrey Mesa研究所(TMRI，San Diego， CA)。Yates博士工作于TMRI及Scripps研究所(La Jolla，CA)。

　　研究人員應用多維液相色譜、LCQ Deca串聯質譜以及TurboSEQUEST庫搜索軟件進行啤酒酵母BJ5460株的蛋白組研究。這是迄今為止規模最大的酵母蛋白組研究。他們識別了1484種蛋白，圖2列出本研究識別的蛋白類型。

　　以上兩個例子說明不用二維凝膠電泳也可以進行蛋白質的識別。Thermo Finnigan公司的研究是采用一維色譜，而酵母蛋白組的研究則是利用二維色譜技術。他們各自都比以前二維凝膠電泳研究得到的信息多。根據TMRI的研究，二維凝膠電泳消耗時間長，而且在分離低豐度蛋白質、膜蛋白以及分子質量或等電點極端的蛋白質時，效率沒有色譜高。

2 二維凝膠電泳／離子阱質譜聯用的優點

　　與MALDI-TOF質譜相Lh，離子阱質譜用于蛋白質的研究能為二維凝膠電泳的研究提供更加有價值的結果。兩種方法都是從凝膠上切割感興趣的點，然后將蛋白質酶解成多狄。離子階質譜在分析前，利用HPLC將多肽進行分離，這樣可以大大降低混合物的復雜性。

　　二維凝膠電泳／MALDI-TOF質譜技術能提供有用的肽質譜圖且能進行蛋白質的識別。但與LC／MS／MS相比，MALDI-TOF的識別結果不可靠，特別是當一個點中含有多個蛋白時。對于一個點的水解蛋白液來說，其中含有大量的多肽，并且經常含有修飾基團。一般來說，一個蛋白能水解出20～50種肽。用MALDI-TOF質譜測量多肽混合物時，待測組分不能完全離子化，對于一個蛋白得不到足夠的肽信息，無法搜索肽數據庫進行蛋白的識別。而LC-MS-MS聯用能夠檢測到相當高的肽段數量和氨基酸序列，這樣進行蛋白質識別就有了較高的可信度。

　　MALDI-TOF也不能進行翻譯后修飾蛋白質的分析。具有離子阱的LC-MS-MS技術能夠通過解析修飾導致的肽譜質量漂移提供修飾信息，并且能夠提供修飾類型和修飾位點的結構信息。

3 蛋白組的鳥槍法測序

　　以前，許多研究人員就在討論將蛋白質的鳥槍法測序技術(Shotgun sequuencing of protems)，作為快速識別與表征人體中蛋白質的技術。他們從人類基因組計劃(Human Genome Project)中借用了這個詞，人類基因組計劃利用鳥槍法測定了人體基因序列。

　　鳥槍法測序也適合于蛋白組研究，但是要確定它在基因組中和在蛋白組中定義的不同是非常重要的。鳥槍法測序在蛋白組研究中切實可行，但遠比在基因組中的應用復雜。

　　鳥槍技術對于人類基因的應用，包括利用聚合酶鏈反應(PCR，Hoffman-La Roche，Nutley，NJ)技術進行DNA克隆。研究人員將完整的基因在化學上碎裂成含有2000一10000個堿基的碎片。DNA的4種堿基中的每一個??腺嘌吟、胸腺嘧啶、胞嘧啶及鳥嘌吟都能在化學上修飾而發出它們獨特顏色的熒光。用凝膠分離這些碎片，掃描后，用激光按顏色識別堿基序列。將這些序列信息輸入計算機，該計算機能夠記住這些碎片來源于何處且把來自掃描的信息放到原來的位置。用這個方法能夠最終得到整個基因序列。

　　這是一種值得注意的技術，但它不同于蛋白質的鳥槍法測序技術。例如，通過PCR得到的DNA樣品是比較簡單的，基因是比較穩定的，它們的一般結構是可預測的，這些都使得基因的測序簡單化。

　　蛋白質不只是由4種堿基組成，而且在另一方面蛋白質還是由20種氨基酸組成，因此比基因復雜得多。它們不能被克隆，樣品的獲得和處理變得更加困難。并且蛋白質分子非常大，結構不像基因那樣可以預測。因此鳥槍法測序過程是很不相同的。為了測定蛋白組中這樣的序列，首先將蛋白質酶解成多肽，然后將這些肽進行分離、離子化、分析并用MS檢測。利用得到的肽質譜信息，搜索已有的蛋白質庫，或者通過從頭測序的方法，對數據庫不存在的新蛋白質進行全序列測定。

　　蛋白質與基因不同，它非常不穩定，豐度和含量差別很大，細胞的代謝途徑受蛋白質與蛋白質之間的相互作用的影響。綜合這些因素，我們可以公正地說，在生物系統環境下基因測序就像進行一次快照，而對于蛋白來說就像進行一部電影的拍攝。

　　對于蛋白組的鳥槍法測序任務，離子阱能非常好地提供碎片信息??MS能進行n級掃描，這是非常有價值的。由于可以進行n級質譜碎片掃描，因此可通過對肽片進行多次裂解而得到特異性的識別與鑒定。

　　Thermo Finnigan 提供了Dynamic Exclusion ^TM這一部件，它增加了許多功能進行蛋白分析。Dynamic Exclusion首先進行全掃描來測量多肽峰和相對豐度。然后依次調節吸收強度、數據處理系統使離子阱分離并記錄選定的離子的裂解質譜圖。最高強度的離子被分隔并成碎片，然后是次高強度的離子成碎片，再后是第三個，甚至豐度很低的肽段離子也可以用這種全自動的模式得到檢測。這就使高通量、自動化的蛋白質分析和翻譯后修飾的全范圍檢測得以實現。

4 結論

　　蛋白組領域需要快速的分析工具來識別和鑒定蛋白質。LC-MS-MS離子阱質譜提供了高的速度和高的靈敏度，非常適合于蛋白組領域的研究。離子阱質譜作為一個廣泛采用的技術，能為蛋白組的研究提供大量可靠的信息。