蛋白組的高通量分析

可把蛋白組學定義為生物系統中所有蛋白質的全部表征。這種方法不僅包括蛋白質的定性分析，也包括對所選蛋白質子集的定量分析、轉移修飾后的表征以及蛋白質。蛋白質之間關系的解釋。研究發現，在一個單細胞中含有數千個蛋白質，這就需要發展新的儀器設備進行全蛋白質的分析。本文介紹了基于高效液相色譜（HPLC）-質譜（MS）分析的蛋白質組工作站。為了提高HPLC分離系統的分辯能力，采用了與離子交換色譜聯用的二維高效液相色譜技術。在離子交換色譜中根據電荷的不同，使蛋白質酶解液中的膚混合物得到分離，接著通過反相高效液相色譜法，根據肽的疏水性的不同進一步實現分離，最后利用超靈敏度的質譜對肋進行檢測。

Proteomics may be defined as the complete characterization of the full complement of proteins in a biological system. Such an approach includes not only the identification of proteins but also the quantitation of selected subsets of proteins, the Characterization of post-translational modifications, and the elucidation of protein-protein interactions. Given that thousands of proteins are found in a single cell, this is a daunting task that will need advances in instrumentation. The proteomic workstation described in this article is HPLC-MS based. To increase the resolving power of the HPLC separation, 2-D HPLC techniques are employed using a combination of ion exchange chromatography, where the peptides from a tryptic digest are separated by charge, followed by RP-HPLC, which separates peptides by their hydrophobicity. An ultrasensitive mass spectrometer is employed, for detection.

      最近已經有一些實驗室利用二維高效液相色譜法進行了蛋白質混合物的研究^[1，3]。本文將蛋白組學定義為生物系統中所有蛋白質的全部表征。這種方法不僅包括蛋白質的定性分析，也包括對所選蛋白質子集的定量分析、轉移修飾后的表征(例如蛋白質的磷酸化和蛋白質的糖基化)以及確定蛋白質-蛋白質之間的相互關系及作用途徑。

　　鳥槍法結合二維高效液相色譜-質譜方法(LC-MS)用來分析蛋白質混合樣品。用合適的蛋白酶(一般為胰蛋白酶)酶解蛋白質混合樣品，把生成的肽混合物進行HPLC分離，然后用串聯質譜將分離后的肽特征化。將得到的質譜碎片信息與基因組庫或者蛋白組庫的預測結果相比較來進行蛋白質的定性。由于胰蛋白酶的特異性導致蛋白鏈在賴氨酸和精氨酸的C?端斷裂，使大多數的肽在低的pH下帶有雙電荷。許多蛋白質組的研究是利用單一的二維反相高效液相色譜分離、質譜檢測的方法，這種方法易受到色譜柱容量及質譜檢測能力的限制。反相高效液相色譜與離子交換色譜聯用的二維高效液相色譜技術，提高了HPLC分離系統的分辯能力，蛋白質酶解液中的肽混合物在離子交換色譜中根據電荷的不同被分離，接著通過反相高效液相色譜法，根據肽的疏水性的不同進一步實現分離。這種方法大大降低了在任意給定的時間點上質譜分析多肽混合物的復雜性，使得特殊的多肽得到檢測，特別是含量少的或者離子化能力較差的多肽能夠被檢測。

　　現在一些研究小組已經建立了二維高效液相色譜實驗平臺^[3,4]、ProhomeX ^TM Worksration(Thermo Finnigan，San Jose，CA)是應用到蛋白質組學研究的第一個商業化系統。圖1所示的系統，是由一個自動進樣裝置、兩個延遲體積小的HPLC泵、一個10通轉換閥和LCQ ^TM Deca XP離子阱質譜儀(Thermo Finnigan)以及一個直角微電噴霧接口組成。

 
　　兩個高效液相色譜泵能夠滿足多級色譜步驟流動相的選擇。10通轉換閥具有精細制作的構造，能夠滿足應用的多變性。lCQ Deca XP離子阱質譜儀能夠用MS和Data Dependent^TM MS-MS對肽進行高靈敏檢測。微電噴霧接口利用一個與LCQ人口成直角的30m金屬針頭，并且用毛細管柱(流速：1?2μL／min)和揮發性較弱的緩沖鹽系統(氯化銨鹽)提供高靈敏度的LC-MS-MS分析。系統的所有硬件都是通過為用戶化的蛋白組界面來控制的。

　　ProteomeX系統使用了一個離子交換和兩個毛細管RP?HPLC柱(Thermo Hypersil-Keystone，Bellefonte，PA)，為蛋白組的應用優化了分辨率、靈敏度、回收率、峰拖尾并減少了背景干擾。BioBasic^TM離子交換柱(Thermo Hypersil-Keystone)(SCX[強陽離子交換柱]，0．32 x l00 mm)是一個高純度的并經過親水化涂層失活處理的硅膠(5pm，300?)制成、含有磺酸功能團的強陽離子交換柱。反相色譜柱(BioBasic，C18，0．18x100mm)也是由類似的高純度硅膠制成并經密封，從而減少非特異性吸附。

　　這個系統有很好的適用性，能夠支撐4種基本方法：1)單柱系統的LC-MS分析；2)雙柱系統的高通量LC-MS分析；3)樣品及其同位素分析；4)二維LC-MS分析。為了說明該系統的功能，現用二維LC-MS分析擬表皮癌細胞溶菌產物的胰蛋白酶消解液。系統構造如圖2所示。首先將樣品加載進入一個SCX毛細管柱中，然后利用一系列不同濃度的NH₄Cl鹽溶液將部分樣品傳輸到兩個交替的反相毛細管柱中。盡管每一次鹽洗脫的樣品溶液中含有數百種膚，但與所有樣品中含有的肽相比較，大大降低了勵目毛細管柱中樣品的復雜性。經過反相毛細管柱梯度洗脫分離后的樣品利用MS和MS-MS分析，并用TurboSEQUEST^? (Thermo Finnigan)軟件搜索人體蛋白數據庫做定性分析。TurboSWQUEST是Bio Works ^TM．3.0(Thermo Finnigan)的組成部分，是分析蛋白的一個軟件工具包。圖3是反相離子色譜圖，鹽濃度為50、150、250、500 mmol／L，肽從SCX柱中洗脫出來，圖3也表明了每一鹽濃度下所定性出的蛋白質數量。如果需要進一步提高分辨率，ProteomeX可非常容易改變梯度運行條件或者運行更多的鹽濃度洗脫步驟。一個完整的蛋白組分析大概需要運行15個鹽濃度洗脫步驟^[1，2]。

 　　由TurboSEQUEST軟件定性的蛋白質結果見表1。 由表1可見，利用二維高效液相色譜系統能夠定性出864種蛋白質，而一維系統(反向)僅有341種。二維系統的另一個優點是每一個蛋白質中有更多的肽得到分析檢測，并且定性的可靠性也得到提高(數據沒有顯示)。對于較少的蛋白混合樣品而言，一維系統能夠滿足要求并且所需的分析時間較短。表2列出了一部分利用Turbo-SEQUEST軟件定性出的蛋白質。

結論

　　ProteomeX Workstation的采用使蛋白組研究工作者能夠可靠地進行復雜樣品的分析。利用多維液相色譜法可以大大增加在給定的樣品中定性出蛋白質的數量，用戶化的ProteomeX軟件界面使研究人員對復雜的多維LC-MS方法易于編程。LCQ Deca XP離子阱質譜的穩定性和耐用性使得在很長時間內的分析具有可靠性，這對于分析時間長、步驟多的二維LC-MS分析實驗來說是非常重要的。

參考文獻:

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