用微型化裝置提高生命科學中的分析速度

通過儀器的更加小型化、集成化以及更少的花費和更高的分析速度，芯片實驗室(lab-on-a-chip)概念促進了化學分析的變革。通過基因分析和高通量篩選中的應用，本文介紹了小型化復制的塑料儀器中的電泳分離性能。研究表明，其結果與傳統測定的結果是一致的。

The lab-on-a-chip concept will contribute to a revolution in chemical analysis by making tools smaller, more integrated, less expensive, and faster. In this article, the performance of electrophoretic separations in miniaturized replicated plastic devices is described for applications in genetic analysis and high-throughout screening. The results of these stucties are shown to be consistent with those from conventional measurements.

        近年來，小型化化學分析系統引起廣泛關注。與計算技術小型化類似，芯片實驗室(lab-on-a-chip)的概念激發了化學分析的變革：使儀器更小、集成度更高、價格更低、分析速度更高。這種裝置可能像人手那樣大或更小，通常比目前試驗室的小型裝置更小。整個分析過程都能夠在這種小型化、集成化和自動化裝置中完成。該系統能夠有效地改善傳統實驗室分析速度低的不足，同時由于制備成本較低，也節約了分析成本。因此。用該裝置實現低成本高通量分析成為可能。除了能夠實現快速分析之外，對于體積小的復雜樣品而言，芯片實驗室裝置能夠減少人為誤差、避免污染并能帶至現場應用。潛在的應用領域包括高通量篩選、環境監測、臨床檢驗、空間生物學、原位(point-of-care)診斷、生物戰爭試劑檢測、高通量DNA排序和基因組合等。第一例高度微型化的分析系統是將GC集成于平板芯片上^[1]。由于該芯片分析系統所需樣品量非常少，所以特別適于生化和化學檢測。本文中，作者將介紹在復制的塑料LabCardTM微型化電泳裝置(AClARA BioSciences，Mountain View，CA)上進行基因分析和高通量篩選。

1 微型化塑料電泳裝置

　　聚合物制造技術已用于在塑料基質平板上制備微通道用于電泳分析。塑料LabCard裝置就是在固體基質(玻璃、硅、鎳)上面通過注塑模、壓模、鑄模或熱塑等方法精確制備微通道。固體基質可通過直接化學腐蝕材料，對于鎳基質也可通過電鍍鎳等直接刻蝕得到。用另外的平面塑料將這些熱塑或鑄模覆蓋，兩者之間通過熱熔或膠粘密封，覆蓋層厚度可與模基相同或不同。本文介紹的分析結果均為在丙烯酸基聚合物模制備裝置上獲得。電泳是生命科學研究中應用最多的分離分析方法之一。這種方法基于在電場作用下荷電分子的移動來完成分離，電泳能夠分離不同荷質比的分子(在原始狀態下的蛋白質)或荷質比相同但分子量不同的分子(如DNA片段)。近年來毛細管電泳(CE，在熔融石英毛細管中充入緩沖溶液)提高了分離速度。平板、微通道裝置在CE基礎上又進行了改進。毛細管和微通道裝置的電泳通道相似，但微通道的平板型交叉通道比單一的毛細管電泳通道更復雜，功能更多。例如。交叉通道裝置能夠注入比傳統CE更少的樣品注射量，由于注射樣品寬度狹，所需分離長度減少，分離速度更高，但分離度并沒有降低。

2 基因分析中DNA的分離

　　電泳是核酸分析中最主要的技術，如人類和其它動植物的基因序列是通過電泳分離分析DNA片段得到堿基序列的。此外，電泳也用于基因圖譜確認，包括人的特性鑒別、表達分析、病菌分析、突變檢測、藥物研究等。隨著人類基因組項目的完成，研究方向轉向單個藥物，DNA分析市場有望繼續快速發展。因為核酸片段的荷質比與長度無關，所以傳統的核酸分離，是在作為一個篩子的纏結聚合物溶液中基于片段大小進行分離的。圖1是在微通道中快速分離常見不同分子量的DNA片段的電泳圖，DNA片段之間相差100個堿基對。為了檢測DNA片段，把染料添加到聚合物篩分介質中，染料嵌入DNA片段結構中后，能夠被激光激發發出熒光。上述DNA片段在半分鐘內就能完全分離，分離通道長度只有2mm，而在傳統電泳或平板電泳中完成分離至少要半小時。采用該系統，在稍長的通道中也能夠基線分離長度僅相差1．3％的雙螺旋DNA片段，分離時間不到6min^[2]，該項分離可用于人的特性確認。多通道塑料LabCard也能在性能復雜、前后重復的等位基因(人與人之間長度不同的基因部分)圖譜的高通量檢測中得到應用[3]。

　　塑料微通道裝置也可用于分離DNA序列。在這種分離中，要求能夠分離長度僅相差一個堿基(如1000個中相差1個堿基)的片段，以便確認堿基序列。能夠從分離譜圖中讀出的堿基的最大數目稱作閱讀長度。目前，確定的堿基最大數目達到600，30min完成，準確率達99%^[2，4]，而用商品自動測序儀完成相應的任務則要幾個小時以上。

3 以電泳為基礎的高通量篩選酶分析

　　為了加快新藥開發，近幾年高通量藥物篩選是迅速擴展的領域^[5]。與傳統技術相LL，微流技術在該領域具有非常突出的優勢：明顯減少樣品用量、精確快速定量和流線型的化學體系^[6，7]。對于這些優勢。LabCard系統均能滿足，并且其低成本高容量的優勢極大地滿足了藥物開發的需要。除此以外，由于藥物篩選的目標是生物分子(酶、受體等)，它們在裝置上的吸附是值得注意的問題，而LabCard裝置的惰性表面則為藥物篩選提供了一個極好的平臺。

　　在高通量藥物篩選(HTS)中，高準確度和快速非常關鍵。通過典型的酶分析可以證明微通道電泳裝置的速度和準確度。該裝置是利用熒光標記基質與酶、激酶和實驗室未知化合物反應，通過電泳分離熒光標記基質和產物，用產物和基質相對峰面積確定未知化合物是否對激酶活性有抑制作用。圖2是多通道塑料LabCard裝置上典型的酶分析變化圖，第一個峰是內標，用于檢測通道尺場有望繼續快速發展。因為核酸片段的荷質比與長度無關，所以傳統的核酸分離，是在作為一個篩子的纏結聚合物溶液中基于片段大小進行分離的。圖1是在微通道中快速分離常見不同分子量的DNA片段的電泳圖，DNA片段之間相差100個堿基對。為了檢測DNA片段，把染料添加到聚合物篩分介質中，染料嵌入DNA片段結構中后，能夠被激光激發發出熒光。上述DNA片段在半分鐘內就能完全分離，分離通道長度只有2mm，而在傳統電泳或平板電泳中完成分離至少要半小時。采用該系統，在稍長的通道中也能夠基線分離長度僅相差1．3％的雙螺旋DNA片段，分離時間不到6min^[2]，該項分離可用于人的特性確認。多通道塑料LabCard也能在性能復雜、前后重復的等位基因(人與人之間長度不同的基因部分)圖譜的高通量檢測中得到應用^[3]。

　　塑料微通道裝置也可用于分離DNA序列。在這種分離中，要求能夠分離長度僅相差一個堿基寸可能的偏差及注射過程性能。產物、基質和內標物在7．5s內分離。本實驗中，培養與分析過程在同一塊板上進行，如果培養與分析過程獨立，總分析時間的限制將不再取決于培養，而受分析時間限制。

　　分離藥物篩選方法最重要的優點是能夠清楚地定量檢測，因為分析過程中基質改變能夠完全與分離峰相關聯。圖2顯示的激活酶分析就是一個極好的例子。基質和產物的基線分離，使其容易準確定量。在大多生化分析中，生物分子結構會改變，因而也會改變分子的電泳淌度。電泳淌度的改變在電泳分析中是必需的。

　　為了對LabCard分析方法與傳統方法進行比較，作者選用了已知抑制效率的適當化合物，測定IC50(反應能力被抑制50％的濃度)。反應過程在LabCard裝置上和在試管中反應后進行分析，得到的IC50值均為0．5?0．6μmol／L(圖3)，與傳統方法側得的0．5pmol／L結果相當。檢測了10多個化合物，其一致的結果表明，這種裝置適合作為藥物篩選工具。

4 結論

　　本文列出的幾例證實了在可復制的塑料LabCard微通道裝置上快速電泳分離可在2個領域應用：基因分析和高通量篩選。在未來幾年，LabCard裝置會集成更多的結構，實現樣品?結果裝置(sample-to-answer)或集成實驗室裝置(labs-on-a-chip)。

參考文獻:

1. Teny SC, Jerman JH, AngeU JB. IEEE Trans Electrbn Devices 1979;ED-26: l 880-6.

    2.   Sassi AP, Ricco AJ, Hooper HH. For electrophoresis,smaller is faster. Todays Chem Work 2000;Feb:52-7.

    3.   Sassi AP, Paulus A, Cruzado ID, Bjomson T, Hooper HH. Rapid, parallel separations of DIS80 alleles in a plastic microchannel chip. J Chromatogr A 2000;accepted for publication.

    4.   Tan H, Williams SJ, Kao P, et al. DNA sequencing on microfabricated plastic chips. Saarbrucken, Germany.HPCE 2000, oral presentation LO57.

    5.Brush M. Automated laboratories: high throughput technology picks up stream. Scientist 1999;13:22-5.

    6.Gibbons I. Micronuidic arrays for high-throughput submicroliter assays using capillary electrophoresis.Dnlg Disc Today 2000;(HTS supplement) 1:33-7.

    7.Cohen CB, Chin-Dixon E, Jeong S, Nikiforov TT. A microchip-based enzyme assay for protein kinase A.Anal Biochem 1999;273:89-97.