質譜用于河水、污水中的雌性激素化合物的檢測

引言

　　近幾年來，雌性激素對水環境中影響越來越大，因為這些化合物在濃度低至0.1 gn/L 時，都會導致雄性魚的雌雄間性的變化。所以，需要一種具有靈敏度和選擇性高的分析方法用于復雜樣品中的雌性激素化合物的檢測。

　　三類化合物被確定為會導致內分泌干擾的化合物，即天然產生的雌酮（E1），雌二醇（E2），和第三類合成雌激素－乙炔基雌二醇（EE2），它具有最高的內分泌干擾作用。它們的結果參見圖1。

　　按照傳統的分析方法，這些化合物都是在與如七氟丁酸酐，五氟丙酸及許多硅烷化試劑衍生化之后，用GC/MS 或GC/MS/MS 檢測的。這種方法樣品前處理非常復雜，增加了樣品制備的時間。

　　使用液質聯用技術分析雌激素，是不需要衍生化的。然而，單四極桿液質技術在分析復雜基體樣品中如此低含量的雌激素時，其選擇性會有所限制。近來，飛行時間質譜（TOF）技術的發展大大提高了TOF 的質量分辨率，一般在250－300 amu 范圍內，可以達到0.04 amu 的精確度。這個范圍適用于雌激素而且分辨率比四極桿質譜高至少一個數量級。更高的質量分辨率意味著降低樣品或基質中非目標化合物的干擾。質量精度的提高可以得到化合物的精確質量數，因而得到更高的分析選擇性[1,2]。

　　本文介紹了三種雌激素的檢測方法，包括樣品的保護、提取，凈化和用大氣壓光離子化－液相/飛行時間質譜儀分析的所有步驟。其檢測限（LOD）小于0.1 ng/L 以及對于實際樣品的相對標準偏差（RSD）小于15%，回收率高于90%。

樣品制備

　　在早期工作中，如果開發廣泛而實用的分析方法，樣品穩定性是一個必須考慮的因素之一。穩定性實驗發現，保護劑可以滿足要求。

　　樣品制備中應先加入保護劑，然后經過三個制備步驟。所有的樣品制備都是全自動的，幾乎不需要操作者介入。

　　第一步是固相萃取濃縮的步驟。在這一步，800 毫升水樣濃縮至4 毫升。

　　第二步是用正相色譜梯度洗脫，然后自動收集相應的餾分。制備液相采用Agilent 1100 制備液相系統，包括二元泵、控溫多孔板自動進樣器、柱溫箱、可變波長檢測器和控溫餾分收集器。

　　第三步是采用體積排阻色譜（SEC），然后自動收集相應的餾分。

樣品保護

　　本應用文獻中的樣品保護方法是在1 升樣品中加入0.25 克硝酸銅和1 毫升濃鹽酸。樣品被儲存于5℃的條件下（參見表2）。

樣品制備第一步

　　固相萃取柱（Baker）是添有200 毫克SDB1，體積是3 毫升。所有的步驟都是在Zymark AutoTrace 系統上全自動進行的。

　　每一個萃取柱序列用5 毫升乙酸乙酯，3 毫升甲醇和3 毫升色譜純的水活化。

　　1. 800 毫升樣品加入內標，然后以10 mL/min 的流速通過已近活化的固相萃取柱。污水樣品先用去離子水稀釋5 倍（即200 毫升稀釋至1000 毫升），然后加入內標。

　　2. 每一個固相萃取柱用3 毫升60% 甲醇，然后用3 毫升色譜純的水序列清洗。

　　3. 固相萃取柱用空氣干燥40 分鐘。

　　4. 2×1.5 毫升乙酸乙酯加入經空氣干燥的每個固相萃取柱。收集洗脫液，最后再加入1 毫升乙酸乙酯。

樣品制備第二步

　　在這個步驟，采用正相色譜（NPC）和餾分收集。樣品萃取液在45℃下用氮氣吹干，大約吹30－45 分鐘。然后溶解于0.25 毫升的環己烷：異丙醇（95:5）的溶液中，然后再用第三步進一步凈化。

樣品制備第三步

　　在本步驟中，將采用體積排阻色譜（SEC）和餾分收集。從第二步來的樣品吹干（45℃），殘留物再用0.25 ml的二氯甲烷溶解，然后用下列的條件凈化：

　　收集的餾分經氮氣吹干（45℃），殘留物再用0.2 毫升的甲醇:水（10:90）溶解。最后，準備用液質分析。

定性分析

　　所有的分析都是在安捷倫的液相色譜/飛行時間系統上進行的。液相色譜/質譜包括安裝大氣壓光離子源及Agilent 1100 液相色譜儀，以反相模式分析。1100 液相色譜由微量真空脫氣機，二元泵，柱溫箱，多孔板自動進樣器。另外一個單元泵用于輸入參比離子的導入。

結果和討論

校正標準溶液的制備

　　2 ng/L 標樣的典型色譜圖參見圖2。對于800 pg 的柱上進樣量，其信/噪比在200 到400 之間。檢測限約為20－40 pg 之間。

　　在這個反相色譜圖中，三個目標化合物全部是基線分離。

　　采用內標化合物進行標準校正曲線的建立。三個內標分別為氘代4 雌酮，氘代5 雌二醇和氘代4 乙炔基雌二醇。內標的準確質量數分別為273.1798，276.2017和299.1954。

　　利用四點建立校正曲線，濃度分別為0，0.008，0.04和0.10 mg/L，所有標準溶液都含有濃度為0.02 mg/L的內標。校正標樣最后相當于0，2，10，25 ng/L，內標標樣的濃度為5 ng/L。

雌酮的校正曲線見圖3。

穩定性數據

　　對于獲得高質量的數據的基本要求是要保證雌激素在樣品基質中保證穩定。若沒有樣品保護劑，化合物可能會快速降解，尤其在廢水中。結果參見表1。

　　從表1 的結果可以看出，在沒有加入保護劑時，兩天之后，雌激素有明顯的降解，雌酮和雌二醇降解最明顯，冷藏會降低化合物降解的速度。在有保護劑的條件下，化合物的常溫降解速度大大減慢，加上冷藏時，在15 天內，只有低于10% 的雌激素降解。數據結果參見表2。

　　圖4-9 所示為提取離子流色譜圖的例子。

回收率和精密度數據（%RSD）

　　用11 批次的樣品進行分析方法的驗證。樣品包括添加0.1，2.0 或20.0 ng/L 的去離子水，河水，另外添加2.0 或20.0 ng/L的河水，最后流出廢液樣品，和另外添加2.5 或15 ng/L 最后流出廢液樣品，污水和添加25 ng/L的污水樣品，詳細地參見表3。

樣品背景水平

檢出限（LOD）和定量限（LOQ）

　　檢出限（LOD）：整個樣品的標準偏差× 4.65
　　定量限（LOQ）：精密度× 2 + 偏差（Bias）

精確質量數測定和質譜圖測定

　　可以通過測量各種基質樣品中的雌激素的精確質量數來得到方法的選擇性。將測量的質量數或絕對偏差與理論值比較。偏差越小，可信度越高。質量偏差受樣品基體背景及共流出峰的影響。對于測定的三個雌激素，10 ppm 相當于0.003 質量單位的誤差。在負離子模式下，測定的三個雌激素的精確質量數如下：

　　表5 所示為在各種基質樣品中，測定的三個雌激素的質量誤差。數據是來自方法驗證的那批樣品的數據。

結論

　　方法的目的是得到每一個雌激素的定量限（LOQ）。所有的結果總結于表4 中。對于各個雌激素的定量限，乙炔基雌二醇，好于0.03 ng/L，雌二醇，好于0.3 ng/L和雌酮，好于1 ng/L。

　　回收率在89.4－108.9% 之間，對于河水和最后流出物的精密度優于15% RSD。對于測量的質量數精度，除了兩個污水樣品之外，所有的數據的質量精度均小于5 ppm， 所以結果具有很高的可信度。總的來說，此分析方法具有高靈敏度，高選擇性的優點。