使用GC/MS 篩選926 種農藥和內分泌干擾物

引言

　　幾年前安捷倫科技在氣相色譜（GC）和氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用上引進了保留時間鎖定（RTL）的概念。只要使用相同的初始方法和相同的色譜柱，RTL 軟件使得世界上任何實驗室的任何安捷倫GC 或者GC/MS 上的保留時間再現成為可能（1）。既然任何實驗室都可以重復另外一個實驗室的保留時間，那么就可能創建包含保留時間鎖定的質譜數據庫。通過在數據庫上鎖定方法，使用者可以在GC/MS 文件中篩選數據庫中的所有化合物。通過“命中數”（Hits）來確定正確的保留時間和正確的譜圖，從而排除假陽性結果，提供更精確的化合物確證（2）。

　　最近，安捷倫引入了解卷積報告軟件（DRS），結合了質譜解卷積和傳統的數據庫檢索和定量技術。解卷積報告軟件是三種不同GC/MS 軟件包的結合：

　　1) 安捷倫GC/MS 化學工作站
　　2) 結合NIST ‘05 質譜庫的NIST質譜搜索程序
　　3) 同樣來自NIST的AMDIS 軟件

　　以前的解卷積報告軟件作為一種廣泛的農藥分析解決方案，包括了567 種農藥和可疑內分泌干擾物的質譜圖（AMDIS 格式）和鎖定的保留時間（3）。

　　最近，安捷倫推出了一種最新擴展的農藥和內分泌干擾物數據庫（部件號G1672AA），包括926 種化合物。在以前的數據庫基礎上，增加了359 種新的化合物到。同時，安捷倫也推出了解卷積報告軟件的新版本（部件號G1716AA 版本A.03.00），可以在任何安捷倫推出的或者用戶自建的解卷積報告軟件數據庫上使用。

農藥和內分泌干擾物數據庫的內容

　　G1672AA 農藥和內分泌干擾物數據庫包含所有可用GC 分析的農藥，包括最近推出的農藥。另外，還包括大量的代謝物，更多的內分泌干擾物，重要的多氯聯苯和多環芳烴，一些染料（如蘇丹紅），人造的麝香化合物以及一些有機磷阻燃劑。

　　新的數據庫包括：

　　? 安捷倫GC/MS 化學工作站的常規分析質譜數據庫
　　? 篩選數據庫，集成到安捷倫GC/MS 化學工作站上的安捷倫功能強大的篩選軟件
　　? 所有926 種化合物鎖定的保留時間，安捷倫5975或5973 的GC/MS 用戶可以在自己的實驗室重現
　　? 用于安捷倫G1716AA （A.03.00）解卷積報告軟件的文件
　　? 可以裝載到安捷倫的G1701DA（D.02.00 SP1 版本或更高）的電子方法，包含GC/MS 文件所需的儀器參數和解卷積報告軟件處理的數據。這些參數列于表1
　　? 實例文件
　　? 應用報告

　　2005 年11 月29 日，日本政府公布了“肯定列表”（Positive List）制度來規范農藥、食品添加劑和獸藥。設置了758 種化學品的最大殘留限量（MRL），同時從列表中除去了65 種化合物。15 種物質的殘留不得被檢出。其他未提及的農用化學品的最大殘留限量（MRL）一致定為0.01 ppm（4）。新的列表于2006 年5 月29 日實施。

　　在日本的肯定列表里有265 種農藥是用GC/MS 分析。新的G1672AA 農藥數據庫包含了所有這些化合物的質譜圖和鎖定的保留時間。因此，一個實驗室可以在GC/MS 運行后的1~3 分鐘內篩選這265 種“肯定列表”中的化合物和其他幾百種更多的農藥。

實驗

　　表1 列出了安捷倫用于農藥分析的儀器，軟件和分析參數。根據所需的進樣量的不同，可以使用程序升溫汽化進樣（PTV）或者分流/不分流進樣方式。

結果和討論

　　關于以前發表的文章（3，5，6）中介紹過的解卷積報告軟件，總結如下：

　　解卷積報告軟件結合了三個相互獨立的數據分析步驟。首先，GC/MS 化學工作站軟件根據目標化合物的一個目標離子和三個確認離子，對目標農藥化合物進行一般的定量分析。報告給出檢測到并經過校正的化合物的含量。對于數據庫中的其他化合物，將根據解卷積報告軟件中提供的農藥平均響應因子來估計濃度。然后解卷積報告軟件把數據文件發送給AMDIS解卷積圖譜，使用解卷積后的全譜在安捷倫RTL 農藥數據庫中檢索。在AMDIS 可以設置一個過濾器，從而使分析物的保留時間落在用戶指定的時間窗口內。由于保留時間鎖定的作用就是高精確度地再現保留時間，這個窗口一般比較小-一般為10~20 秒。最后，通過AMDIS 解卷積的所有目標化合物的質譜圖在NIST 質譜庫的147，000 種化合物中檢索確證；這一步沒有保留時間要求。

　　此方法很快就被許多實驗室采用，正是由于此方法可以在高含量共流出物基質的干擾下能夠在復雜的色譜圖中確證農藥。事實上，這個解決措施十分有用，好多用戶開始創建自己的解卷積報告軟件數據庫（7）。因此，解卷積報告軟件從農藥數據庫中分離出來，可用于安捷倫提供的或者用戶自建的數據庫。

　　原來的567 種化合物RTL農藥數據庫（G1049A）包括在當時已有的農藥，少量代謝物及大部分可用GC分析的內分泌干擾物質。新版數據庫包括更多的農藥，內分泌干擾物和代謝物。此次更新還包括在食品和水中發現的其他種類的污染物。包括18 種多氯聯苯（PCBs），4 種多溴聯苯（PBBs），一些多環芳烴（PAHs），一些有機磷的阻燃劑，三種重要的毒殺芬同系物和三種蘇丹染料。

解卷積的優勢

　　圖1 顯示了AMDIS 的一個界面，說明了解卷積軟件的強大功能。圖1A 中的白線是總離子流色譜圖，其他三條線是解卷積峰（AMDIS 中的術語）的提取離子流圖。注意總離子流色譜圖中的峰和提取離子峰不在一個位置，這個化合物實際上被共流出物所掩蓋。圖1B 把化合物的解卷積譜圖（白色線）同未解卷積的譜圖（黑色線）重疊放置。很明顯，共流出物掩蓋了這個化合物，使分析不清晰。圖1C 顯示了解卷積的峰（白色譜圖）同數據庫中的噠草伏（黑色譜圖）匹配良好。RTL 農藥數據庫中噠草伏的保留時間是26.933 分鐘，同這個色譜圖中看到的保留時間僅僅相差2.3 秒。譜圖的解卷積和鎖定的保留時間結合使化合物的確證更加明確。

地表水分析-重復早期的研究

　　較早的研究中，比較了安捷倫的解卷積報告軟件和常規的農藥分析（3）。加州農藥管理局（CDFA）提供了在他們實驗室分析的17 種地表水提取物的數據文件。采用安捷倫的農藥分析方法對GC/MS 譜圖進行時間鎖定，從而使得用解卷積報告軟件分析這些文件而不用重新進樣。原來的解卷積報告軟件分析使用的是567 種化合物RTL 農藥數據庫。為了比較，用新的926 種化合物RTL 農藥數據庫重新分析了相同的化合物。下面是其中一個樣品的色譜圖（圖2）和解卷積報告軟件報告（圖3）。

　　除了鄰苯二甲酸鹽，926 種化合物數據庫確證了7 種新的化合物（圖3 中粗體表示）：4-氯苯異氰酸酯（一種苯基脲類除草劑的代謝物）；3,4-二氯苯異氰酸酯（敵草隆代謝物）；磷酸三（-2-氯乙酯）（一種阻燃劑）；咖啡因（一種刺激物）；嘧菌環胺（一種殺菌劑）；去甲基噠草伏（噠草伏的代謝物，一種除草劑）；四丁氧基乙基磷（一種阻燃劑）。雖然一般認為咖啡因不會有危險，之所以包括在數據庫中是因為經常在污水中發現，在下水道中和各種藥物或農藥在一起（8）。

　　這個樣品中，化學工作站在8.941 分鐘只發現了甲基苯駢三氮唑，但是AMDIS 不能確證，包括手動也無法確證。AMDIS 以低的匹配度暫時性確證了叔丁基-4-羥基茴香醚，但是保留時間偏離了-7.7 秒，比其它大多數命中的化合物都要多。這個化合物不在NIST 庫中，所以不能被確證。化學工作站方法要求所有三個確證離子峰在±20% 以內（相對），這對于一個復雜的樣品是很嚴格的。這就解釋了為什么化學工作站找到的化合物很少了。

　　AMDIS 確證了嘧菌環胺（20.563 分鐘），但是NIST數據庫沒有檢索出來。下面一行顯示最好的NIST 匹配是蒽的衍生物，不是嘧菌環胺。當設置AMDIS“可使用未確定峰”時就會出現這種結果，如圖4 所示。當在解卷積報告軟件化合物確證配置中關閉這個選項時，NIST 檢索出的最好的匹配物質就是嘧菌環胺。當化合物的確證中出現像嘧菌環胺這樣不明確的化合物時，同時執行兩種解卷積報告軟件檢索方式并且比較結果是很有效的一種方法。

　　在以前介紹的比較中（3），解卷積報告軟件可以確證所有的CDFA 化學家發現的37 種農藥。然而，解卷積報告軟件完成17 個樣品的測試花費大約20 分鐘，而手動操作需要8 個小時（表2）。而且，解卷積報告軟件發現了CDFA報告中的一個假陽性結果，并且發現了另外34 種農藥和相關化合物。

　　使用新的926 種化合物數據庫，只需要32 分鐘即可完成分析所有樣品，解卷積報告軟件發現了另外的99 種農藥、代謝物、阻燃劑和相關化合物（表2）。

立體異構體的處理

　　很多化合物有多個立體異構體，具有相同的質譜圖。例如，氟氯氰菊酯有三個手性中心產生了四對非對映異構體。很難而且有時也不可能確定這些異構體的洗脫順序，大部分分析工作者按異構體的總量來報告。安捷倫的G1049A RTL 農藥數據庫任意將這些異構體按羅馬字母分配，I 是最早流出的異構體，II 是第二個，依次類推。所有這些異構體都有著相同的CAS號。一般采用CAS 號來確定“不穩定的立體化學品”。這將導致AMDIS 的一些不兼容問題，說明如下。

　　AMDIS 軟件利用“化學品鑒別號”來區別這些化合物。最簡單的和最一致的方法是使用美國化合物的CAS 號。AMDIS 默認的設置就是在分析GC/MS 數據文件時，每個CAS 號只使用一次。這樣看上去更合理，要求數據庫的每個條目都有一個不同的CAS號。在AMDIS 的分析/設置/確證的下拉菜單中選擇條目，可以允許每個化合物有多個匹配。這樣，就會使多個峰具有相同的化合物名稱。

　　在新的RTL 農藥數據庫（G1672AA）中，仍然保留羅馬數字名稱，給系列中的第一個異構體真正的CAS 號。給系列中其它的異構體一個統一的安捷倫編制的CAS 號。真正的CAS 號在條目中化合物的名字之后。例如，氟氯氰菊酯異構體在數據庫中的條目如表3 所示。

　　圖5 說明了兩個數據庫是如何使用AMDIS 配置（每個化合物一對一匹配）來確證在菠菜樣品中的氯菊酯的。使用舊的567 種化合物數據庫（G1049A）因為只用一次CAS 號，所以只確認了一個氯菊酯異構體。使用新版的926 種化合物RTL 農藥數據庫（G1672AA），確證了氯菊酯的兩個異構體。不出所料，用氯菊酯II 的編制CAS 號在NIST 數據庫上沒有匹配。因此，軟件在接下來的一行打印出匹配最好的化合物。這個化合物，環丙基甲酸衍生物就是氯菊酯的異構體。

　　現在，只要在解卷積報告軟件中開啟NIST 數據庫檢索，報告就會在編制CAS 號化合物之后打印出另外一行。注意這些編制CAS 號一般是以999 開頭的9位數字。

結論

　　新的G1672AARTL 農藥和內分泌干擾物數據庫比它的早期版本包括了更多的目標化合物，增加了359 種新的化合物，是目前最全面的數據庫。增加了許多新的農藥、代謝物和內分泌干擾物，例如重要的多氯聯苯，多溴聯苯，多環芳烴，人造麝香化合物，蘇丹染料以及有機磷阻燃劑。此數據庫包括新的日本“肯定列表”制度中所有使用GC/MS 檢測的分析物。結合完整的解卷積報告軟件方法，可以在約兩分鐘的時間內，在每個樣品的GC/MS 數據文件中篩選所有的926 種化合物。對于檢測食品和環境樣品中的這些化合物，這是一種最快、最全面、最精確、最簡單的方法。