牛腎小球基底膜Ⅳ型膠原α鏈非膠原區1 的分離純化及其在抗腎小球基底膜相關疾病中的應用

[摘　要] 目的:分離純化抗腎小球基底膜( GBM) 抗體的特異性靶抗原,并評價其在抗GBM 抗體檢測中的應用價值。方法:通過孔徑不同的篩網從牛腎臟中提取牛腎小球,采用改良的40 g·L - 1去氧膽酸鈉破壞腎小球細胞而獲得GBM ,經膠原酶消化后收集可溶性牛GBM 粗抗原。在pH 7. 5 的條件下經Mono Q 陰離子交換層析柱分離純化腎小球基底膜Ⅳ型膠原α鏈非膠原區1[α( Ⅳ) NC1 ] ,并經SDS - 聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blot 鑒定其純度及活性。應用2 mg·L - 1純化的牛α( Ⅳ) NC1 包被酶標板,建立牛α( Ⅳ) NC1 - EL ISA 方法檢測血清中抗GBM 抗體,并與經典的以人GBM 可溶性蛋白為粗抗原的EL ISA 法進行對照研究。血清來自90 例已知抗人GBM 抗體陽性的患者、100 例正常人和50 例其他腎臟疾病患者。對兩種方法進行相關分析并計算牛α( Ⅳ) NC1 - EL ISA 的敏感性、特異性。結果:純化的牛α( Ⅳ) NC1 經SDS - 聚丙烯酰胺凝膠電泳表現為相對分子質量為25 ×103 和50 ×103的蛋白并可被抗GBM 抗體陽性血清所識別;應用牛α( Ⅳ) NC1 - EL ISA 法檢測抗GBM 抗體的敏感性和特異性分別為100 %和98 % ,與人GBM 粗抗原- EL ISA 的相關性為0. 6 。結論:應用改良的去氧膽酸鈉方法破壞腎小球內細胞并進一步經MonoQ 離子交換柱分離純化牛α( Ⅳ) NC1 ,可以得到高純度的特異性靶抗原;純化的牛α( Ⅳ) NC1可以作為特異性抗原來檢測人抗GBM 抗體。