大腸桿菌、幽門螺旋桿菌中Dps蛋白表達純化及其功能研究

Dps（DNA protection during starvation）蛋白是細菌中特有的一類具有鐵離子結合功能的蛋白，它能保護細胞應對包括過氧化氫、金屬毒性、低PH和高溫等多種逆境壓力。大腸桿菌及幽門螺旋桿菌重組Dps蛋白表達純化研究，為研究Dps蛋白功能提供了理論依據，理解Dps的作用可能有助于人們開發出具有更強靶向性的抗生素和其他的藥物療法。

耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans，DR)是目前世界上已知最強的抗輻射生物之一，以其對于電離輻射等諸多逆境因素的超強耐受和抵抗力而著稱，其抗性機理主要可歸因于其特殊的物質結構和生存方式、對DNA損傷的精確高效修復以及卓有成效的抗氧化體系。Dps蛋白是DR菌抗氧化體系的重要成分，大腸桿菌和幽門螺旋桿菌中均有Dps蛋白。蛋白表達是指用模式生物如細菌、酵母、動物細胞或者植物細胞表達外源基因蛋白的一種分子生物學技術，在基因工程技術中占有核心地位，美迪西提供蛋白表達服務。

1、大腸桿菌Dps蛋白表達純化研究

細菌引起許多嚴重疾病，如食物中毒和肺炎。科學家們面臨的挑戰是，引起疾病的細菌是非常有彈性的。比如，當諸如大腸桿菌之類的細菌經歷饑餓時，它們會大規模地重新組裝它們的DNA，從而使得它們能夠在應激條件下存活下來。 為了實現這一壯舉及提高存活機會，大腸桿菌菌株顯著增加一種被稱作Dps的蛋白的數量。構建表達載體p BVDPSHis，誘導表達并純化DPS單體蛋白，通過非變性PAGE檢測DPS單體自組裝情況，通過質粒在Fenton反應時的降解情況檢測DPS對DNA的抗氧化保護作用。

結果表明，PCR擴增得到522 bp的特異性基因片段，成功構建表達載體p BVDPSHis，誘導表達了分子量為19.5 kD的Dps單體蛋白，親和層析法純化的單體DPS經非變性PAGE電泳證實以多聚體蛋白形式存在，Fenton反應說明Dps具有保護質粒DNA抗氧化損傷作用。原核表達的DPS在體外可以自組裝成多聚體結構具有抗氧化保護DNA作用。 

2、幽門螺旋桿菌Dps蛋白表達純化研究

幽門螺桿菌是一種螺旋狀，革蘭陰性、微需氧性細菌。人群中幾乎一半終身感染，感染部位主要在胃及十二指腸球部。目前已知幽門螺桿菌感染的發病率的高低與社會經濟水平，人口密集程度，公共衛生條件以及水源供應有較密切的關系。我國有研究者進行了幽門螺桿菌Dps蛋白表達純化及活性測定研究。

依照Dps蛋白的基因序列，設計PCR引物，并以幽門螺桿菌基因組DNA為模板擴增Dps基因。將擴增產物回收后連接到pET15b然后轉化大腸桿菌，涂布在抗性平板，37℃過夜培養，然后使用PCR和測序驗證陽性菌落。使用IPTG誘導重組Dps蛋白表達，并通過Ni²⁺親和層析純化。測試Dps蛋白的亞鐵氧化酶活性和抗氧化功能。

結果通過PCR獲得全長為438 bp的Dps基因，成功構建重組質粒pET15b-Dps，它能編碼分子量為18.9 kDa的重組Dps蛋白。使用IPTG誘導目的蛋白表達，然后純化得到Dps蛋白。Dps蛋白能夠快速催化亞鐵離子生成鐵離子。與對照BSA蛋白相比，Dps蛋白具有較強的抑制氧自由基生成的活性。因此構建了重組質粒pET15b-Dps，純化獲得Dps蛋白并測定了其亞鐵氧化酶活性和抗氧化活性。 

此外大腸桿菌DNA結合蛋白克隆表達純化及體外自組裝功能研究表明：Dps蛋白既能通過亞鐵氧化酶活性結合鐵離子對氧化壓力做出應答，又能在氧化并儲存鐵的同時去除了H2O2與Fe（Ⅱ）的毒性，從而保護DNA、蛋白及膜脂免受自由基損傷。另外，在鐵、銅、輻射、高鹽、酸、堿、饑餓或營養不足等脅迫時，一些細菌的Dps蛋白還能非特異性結合DNA，形成一個高度有序且穩定的Dps-DNA復合體，使得染色體從松散易受損傷形態轉變為凝集緊實狀態，從而保護DNA免受各種因素的損傷。

然而Dps蛋白能夠通過自組裝機制成十二聚體發揮相關功能，但自組裝過程的機制與條件尚不明確。因此研究Dps蛋白的自組裝機制，找到其聚合與解聚條件，有助于深層次揭示其蛋白功能，并在生物納米技術以及免疫治療方面發展其可能的應用。