SBP2哺乳動物表達載體的構建和動物模型研究

SBP2缺陷是2005年首次發現的唯一可引起人類遺傳性甲狀腺激素代謝缺陷的疾病，患者表現為以生長遲緩和甲狀腺功能異常為主的復雜臨床癥候群。SBP2 的突變會引起硒蛋白減少，進而導致脫碘酶( deiodinase-2， DIO2) 活性降低和甲狀腺激素代謝異常，以及青春期前生長停滯。進行SBP2哺乳動物表達載體的構建，為分析其對硒蛋白P基因轉錄水平的影響提供了方法。而建立SBP2缺陷的轉基因小鼠模型有助于SBP2缺陷疾病機制和治療的研究。

哺乳動物細胞的表達產物在分子結構、理化性質和生物學功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質分子，可用于重組蛋白藥物和診斷原料試劑盒的開發及應用等。美迪西所提供的哺乳動物蛋白表達系統基于無血清培養體系提供基因表達優化、瞬時表達、穩定表達及抗體生產等多種真核蛋白服務項目。美迪西科研人員建立了成熟的哺乳動物蛋白表達系統及純化服務平臺，提供哺乳動物蛋白表達系統的表達與純化服務。

1、SBP2基因哺乳動物表達載體的構建

克隆硒半胱氨酸插入序列(SECIS)結合蛋白(SBP)2基因，并構建其哺乳動物表達載體，導入293T細胞進行初步表達，分析其對硒蛋白P基因轉錄水平的影響。方法是應用酶切的方法從保存的質粒p CMV-XL4-SBP2中將目的基因切割下來，并利用雙酶切連接法將其連入哺乳動物表達載體pc DNA3.1(+)。

采用脂質體轉染法轉染293T細胞后應用RT-PCR法檢測SBP2基因的表達以及其超表達對硒蛋白P基因轉錄水平的影響。同時在轉染細胞中添加無機硒后研究其對SBP2和硒蛋白P基因轉錄水平的調控。結果成功構建了SBP2表達質粒pc DNA3.1-SBP2，轉染293T細胞后實現基因的超表達，同時添加硒對SBP2基因的表達有明顯影響。

研究發現SBP2基因的超表達顯著提高硒蛋白P的轉錄水平，添加硒進一步增加了硒蛋白P的轉錄。因此 SBP2哺乳動物表達載體的成功構建以及SBP2超表達后的作用分析為下一步深入研究硒蛋白的生物合成機制奠定了基礎。

2、Sbp2基因動物模型研究

SBP2是硒蛋白合成中硒代半胱氨酸摻入的必需因子，純合敲除該基因的小鼠在原腸胚形成前死亡，由此推測攜帶SBP2基因突變的患者體內應殘留部分SBP2的生物學功能。然而該病的具體機制仍未闡明，因此急需建立用于該病研究的動物模型。德國一研究小組建立了Sbp2基因整體和組織特異性敲除的小鼠模型，然而這些模型均未顯示SBP2缺陷患者特有的臨床表型，因此用于該病機制和治療的研究價值有限，新的動物模型尚有待進一步研究。

MCT8是一種甲狀腺激素特異性胞膜轉運體，MCT8基因突變引起一類伴有甲狀腺功能異常的X連鎖精神運動性遲緩綜合癥。自2004年MCT8基因突變患者首次報道以來，已有超過200多例來自100多個不同種族家系的患者存在該基因的缺陷。然而目前尚未建立以皮膚成纖維細胞為基礎的體外模型以研究患者臨床表型與基因型之間的關系。

建立SBP2缺陷的轉基因小鼠模型，以模擬患者的臨床表型常染色體隱性遺傳的SBP2缺陷患者體內仍保留部分SBP2的生物學功能。發現低硒或外源性L-T4刺激的Sbp2雜合突變小鼠部分復制SBP2缺陷患者的甲狀腺功能異常。MCT8基因R388Q突變為良性突變，不影響MCT8的甲狀腺激素胞膜轉運功能。