硒蛋白P的高效表達研究

硒是一種對人體健康有著重大意義的微量元素，與癌癥、神經方面的疾病等密切相關，它大多以硒代半胱氨酸sec的形式存在于硒蛋白中。RPL30、SBP2、Efsec等對硒蛋白的表達具有重要作用，為了研究硒蛋白P的生物合成機制，需要構建反式作用因子RPL30、SBP2和EFsec基因哺乳動物表達載體。

哺乳動物細胞表達外源重組蛋白可利用質粒轉染和病毒載體的感染，利用質粒轉染獲得穩定的轉染細胞需幾周甚至幾個月時間，而利用病毒表達系統則可快速感染細胞，在幾天內使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達產物中檢測出目的蛋白。哺乳動物表達載體必須包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等控制元件。美迪西生物醫藥所提供的哺乳動物蛋白表達系統基于無血清培養體系，提供基因表達優化、瞬時表達、穩定表達及抗體生產等多種真核蛋白服務項目。

RPL30是核糖體大亞基60S的組成部分,由RPL30基因所編碼,主要存在于真核生物中.根據已報道的部分哺乳動物核糖體蛋白L30亞基基因(RPL30)的相關信息設計引物，運用反轉錄PCR（RT-PCR）技術，以大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)的肌肉組織為材料，成功地克隆了核糖體蛋白L30亞基RPL30基因,并對其進行了測序及初步分析。

SBP2是硒蛋白結合蛋白，是硒代半胱氨酸合成的限制因子。SBP2蛋白因子上有與硒蛋白的mRNA結合的區域，在生物體外和體內的實驗均發現SBP2與mRNA結合在一起。有研究表明SBP2在經過一定折疊后，可以與EFsec相互作用，幫助其發揮促進延伸的作用。同時SBP2可能具有避免翻譯在UGA處終止的作用，在硒蛋白合成時，延長因子EFSec需要與SBP2共同作用。EFSec與特定的t-RNA形成復合物，作用于UGA密碼子使其表達硒代半胱氨酸。研究表明在細菌中，通過SELB因子上的EFSec和secis-RNA連接位點，可以把EFSec和secis都帶到核糖體上。EFSec需要與SBP2一起發揮作用。

克隆RPL30、SBP2和EFsec三個反式作用因子基因，并構建其哺乳動物表達載體，然后與重組質粒pcDNA3.1-iGFP-Sepp1共轉染HEK293細胞，研究三個反式作用因子對硒蛋白P基因表達的影響。為實現硒蛋白P在哺乳動物細胞中高效表達奠定基礎。

方法是應用RT-PCR方法從人乳腺癌MCF-7細胞中擴增RPL30基因，利用雙酶切法將其連入真核表達載體pcDNA3.1（+）；采用半合成-酶連法將EFsec基因中所缺失的片段補齊，用PCR方法擴增拼接產物，將其克隆到真核表達載體pcDNA3.1（-）；真核表達載體pCMV-XL4-SBP2購自OriGene生物公司；將三個反式作用因子表達質粒與硒蛋白P表達質粒按照不同的組合方式，采用脂質體轉染法瞬時轉染HEK293細胞；采用RT-PCR法檢測三個反式作用因子的表達及其對硒蛋白P基因轉錄水平的影響。

該研究成功克隆了RPL30基因并構建其表達載體pcDNA3.1-RPL30，準確地將EFsec-基因補齊了其5′端缺失的基因序列，并成功地構建了表達載體pcDNA3.1-EFsec；RT-PCR方法聯合條帶平均密度值分析證實，轉染組與正常組相比，目的基因RPL30、SBP2和EFsec的mRNA水平顯著增高，表明轉染成功并有效表達。

因此反式作用因子RPL30、SBP2和EFsec基因哺乳動物表達載體的成功構建以及其超表達后對硒蛋白P基因轉錄水平的作用分析，為深入研究硒蛋白P的生物合成機制打下了基礎。