分子生物學之聚合酶鏈式反應（PCR）

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR），又稱無細胞克隆技術，是分子診斷的技術之一，此項技術常應用于分子生物學服務，它是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的新方法，該方法一改傳統分子克隆技術的模式，不通過活細胞，操作簡便，在數小時內可使幾個拷貝的模板序列甚至一個DNA分子擴增107～108倍，大大提高了DNA的得率。因此，現已廣泛應用到分子生物學研究的各個領域。目前我國不少醫藥研發外包服務機構例如美迪西，提供分子生物學服務，以支持大分子藥物，小分子藥物、生物制劑、疫苗和生物標記物的篩選與開發及其臨床前研究和臨床研究。

1、分子生物學技術之PCR技術發展歷程：

PCR技術最早由美國Cetus公司人類遺傳研究室Kary Mullis及同事于1985年發現并研制成功的；最早的應用報道是Saiki等1985年將PCR技術應用于β-珠蛋白基因擴增和鐮刀狀紅細胞貧血的產前診斷。隨后使用了1976年Chien等分離的熱穩定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大為簡化，并使PCR自動化成為可能；1987年Kary Mullis等完成了自動化操作裝置，使PCR技術進行實用階段。

　　國內復旦大學1988年起開始研制耐熱性多聚酶，軍事醫學科學院馬立人教授等在1989年研制成功了PCR自動裝置，并且不斷推陳出新，最近研制的PTC-51A/B型DNA熱循環儀體積小，造型美觀，價格適宜，操作簡單，尤為適宜國內應用。

　　PCR發明不到10年，卻已獲得廣泛應用。目前，每年都有上千篇文章發表。1991年，期刊“PCR方法與應用”（PCr Methods and Application）在美國創刊，使有關學者有了自己的論壇和參考的專業期刊。PCR技術作為一種方法學革命，必將大大推動分子生物學各有關學科的研究，使其達到一個新的高度。

1993年度諾貝爾化學將已于10月13日揭曉，Kary Mullis因發明了“聚合酶鏈式反應”而獲得此殊榮。現在世界各地都在使用PCR檢測病人血液中的微量遺傳物質，這一成就為精確診斷艾滋病及其它病癥鋪平了道路。瑞典皇家科學院說：“PCR方法已經廣泛應用于生物醫學中。該方法同DNA測序法結合起來很可能將成為研究動植物分類學的一種革新工具。”一名加拿大籍英國科學家Michael Smith因開創了“寡核苷酸基因定點誘變”的方法而與Mullis同享此榮。

2、PCR的工作原理：

典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應組成一個循環，通過多次循環反應，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是：將待擴增的模板DNA置高溫下（通常為93℃-94℃）使其變性解成單鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復性溫度下分別與目的基因兩側的兩條單鏈互補結合，兩個引物在模板上結合的位置決定了擴增片段的長短；耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因為模板從5’→3’方向延伸，合成DNA的新互補鏈。

3、PCR的用途:

   PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，PCR技術一經問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學的各個領域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構建，基因表達調控的研究，基因多態性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機制的探索，法醫鑒定等諸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有著以下多種用途：

 (1)生成雙鏈DNA中的特異序列作為探針；

 (2)由少量mRNA生成 cDNA文庫；

 (3)從cDNA中克隆某些基因；

 (4)生成大量DNA以進行序列測定；

 (5)突變的分析；

 (6)染色體步移；

 (7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多態性分析等。

目前聚合酶鏈式反應技術已經應用于快速檢測多種傳染病上面，采用PCR技術的恒溫擴增核酸診斷試劑檢測盒體積不大，便于攜帶，檢測起來也很方便。取出病人的痰液、血清等病原體樣本后，加上裂解液、液化液，使用帶核酸親和膜的注射器提取出微量核酸，不需要傳統的離心機處理。經過清洗、洗脫后提取出來的微量核酸放入水浴鍋或恒溫器中，加入DNA聚合酶后，在不變溫度下45分鐘即可完成DNA擴增,擴增后的病原體片段有什么狀況將清晰地呈現在試紙條上。