MRM只提供了一種
質譜的操作模式，具體的樣品怎么做，用來做什么那就看創意了。
不管是內標還是外標都需要有一個標，這個標就是合成的
標準肽段。
外標定量需要做標準曲線。
通常我們合成感興趣的需要定量的蛋白質的proteotypic peptide， 輕同位素，首先按照已知濃度制定標準曲線。
然后測量未知樣品的該肽段的質譜信號強度，根據信號強度反推樣品濃度。
這種定量測量與Bradford法完全一樣。
另一種就是內標法，內標法事一種相對強度法。從某種意義上講，質譜上使用的內標法才是真正的內標法，因為質譜可以分辨同位素的差別(符合
色譜定量內標選擇的基本原則，最好的選擇就是同位素的差別，而其他化學性質基本可以保持一致)。這時我們需要合成的是目標肽段的重同位素對性形式，把已知濃度的重同位素肽段摻入到樣品中在一次LC的run中就可以同時
檢測已知的重同位素的信號強度以及樣品中輕同位素的信號強度，根據兩者的信號相對值就可以計算出樣品中的肽段濃度。
所以，外標法與內標法各有所長：外標法不需要合成重同位素肽段，因此成本可以降低，但是需要多次run，而且多次run的variation也會較大；相反，內標法可以在一次run中搞定，這樣就避免了樣品各次run之間的變異，但是需要合成重同位素肽段。
還好，重同位素只需要特定氨基酸標記就可以了，標準是能夠與相應的輕同位素肽段在質譜上得到分離，最好是同位素峰不會造成相互干擾，這最好至少有4個Da的差別。
外標法的標準曲線有兩種，一種是過原點，一種不過原點，本質上或者說是理論上，標準曲線應該是過原點的，但是由于操作原因或者是實驗本身的特殊原因，可能會不過原點，比如在Bradford法進行蛋白質定量時的標注曲線就不是過原點的，因為在不加蛋白質時仍然會有本底的光吸收，當然我們可以通過多種方式還原真實的狀態，比如在進行光吸收
測定時就進行歸零，或者在繪制標準曲線是直接把截距歸零。但是要注意這樣做的一個前提是各個測量點具有相同的本底，即基線，注意是基線，而不是噪音。這種基線與噪音的本質區別是基線不會淹沒信號，信號永遠在基線之上，即基線只會使信號升高，通過與blank做減法就可以得到真實的信號強度，而噪音則會淹沒信號，若信號強度不是很高，即通常我們所說的信噪比不高，我們就不能把真實的信號剝離(得到真實的信號峰型)。
由于質譜的靈敏度很高，質譜(色譜也是一樣)上測定的信號就會被噪音淹沒掉一部分，當信噪比高時，噪音對定量結果的影響不是很大，反之就會對定量的影響急速增加，特別是在內標定量法上，噪音的影響特別值得注意。有噪音引起的截距變化是不能通過簡單的截距歸零或者直線平移解決的。
質譜外標法定量標準曲線理論上應該是過原點，較小的截距，特別是負截距都是可以接受的，特別考慮到噪音的影響，使具有一定濃度的標準品也不一定有信號反饋。簡單的說就是一個Bradford定量法。
對于質譜內標法的定量的數據處理，目前有很多的方式。上面說過，內標法其實就是一個相對強度法，但是這里也存在一個線性回歸的問題，默認是一個包括原點在內的兩點定一線。這里面有很多的細節問題需要謹慎處理。比如到底是用峰面積還是用峰高來定量。當然這個問題在外標法中也會遇到。對于較好的峰型，不存在這個問題，因為峰高與峰面積的定量結果是一致的，為什么是一致的呢？
對于兩個正態峰來說，任何一點的峰高之比理論上都是相同的，所以面積只不過是把所有的點的峰高進行積分而已。若峰型不規則(不對稱，嚴重拖尾，以及出現裂縫肩峰等)就不符合上面說到的這個原則，自然峰高與峰面積的定量結果就不一致了。
第二個需要考慮的問題就是噪音，當信噪高時噪音對定量結果的影響不大，可以忽略，但是當信噪比較低時，若直接采用噪音之上的信號，無論是峰高還是峰面積都會造成很大的誤差。
2009-12-08 13:33
