生物電分析化學的興起

今天，生命科學已經成為最活躍的研究領域之一。將生物學、化學與工程學結合起來，就形成了生物工程學。采用生物工程學方法，不僅可以增加產量，而且可以生產出許多新的品種來。毫無疑問，這種方法已經在農業、醫藥和工業上取得了引人注目的實際應用。

在生物工程學研究領域中，需要對各種各樣的生物分子進行分離、鑒定和結構表征，這就要用到各種各樣的分析方法。目前，有好幾種分離、分析方法已經成為生物工程學的主要研究手段，如電泳法、色譜法、免疫法及各種用于分子結構測量的近代儀器分析方法等。當然，這幾種方法還需要不斷地加以改進，才能適應生物工程學繼續發展的需要。然而另一方面，電分析化學對于解決生物工程學方面的問題，目前尚顯得軟弱無力。可是，正是這種新的挑戰，開拓了電分析化學的一個新的生長點——生物電分析化學。

電分析化學是一門具有悠久歷史的學科，但它決不是一門行將衰亡的學科;相反，由于近年來各種新的電分析化學技術的不斷涌現，使電分析化學的研究工作呈現出一派興旺發達的景象。電分析化學具有靈敏度高、儀器簡單、方法靈活多樣等特點，所以，將這些豐富多彩的電分析化學技術應用于研究生物物質，一定能得到許多新的重大的成果。

生物體系是一個十分復雜的體系。各種生物組分的分子量相差極大，而許多組分的含量極微。此外，不少生物組分沒有電化學活性;蛋白質等大分子化合物由于吸附作用對測定產生干擾等。所有這些因素，對電分析化學方法都是極為不利的。盡管如此，電分析化學方法在生物體系的研究中已經取得了可喜的成果。

二　 生物電分析化學概況

電分析化學技術在生物體系研究中的應用是多方面的。概略地說，大致有以下幾個方面。

1.生物微量元素的測定及其在生物、醫學及生物無機化學中的應用 這方面的工作大家比較熟悉，如電極法測定pH、po2、pco2、K+、Na+、Cl-、Ca2+等，已成為臨床檢驗中的常規手段。許多重要的微量元素，如Se、Mo、Co、重金屬等，用極譜催化波法和溶出伏安法進行測定，已達到了很高的靈敏度。

2.生物體中氨基酸、蛋白質、激素、碳水化合物等重要組分的測定在這一方面，酶電極和組織電極的應用特別受到重視，因為它們可能為體內這些重要組分的測定提供簡單、直接和連續的分析。當然，伏安法由于其靈敏度高，特別是由于伏安免疫法的出現，可以看出，它們在這一領域的研究中具有很大的潛力。關于這方面的內容，下面將要著重加以介紹。

對某些生物組分的氧化還原機理進行研究，是生物電分析化學的另一個重要的研究課題。在一這方面，循環伏安法及光譜電化學法是重要的研究手段。采用這些方法，可對某些蛋白質，細胞色素C、尿酸、嘌呤、鐵-卟啉及含硫生物物質等的電還原機理進行研究。通過這些研究，對人們認識它們在生物活體組織中在酶的催化作用下所進行的氧化還原機理，有很大啟發。

3.生物體中某些微量藥物成分的測定及其在藥物作用機制研究方面的應用 許多抗菌素、抗癌藥物、鎮靜劑及強心藥等，均已采用電化學方法進行了研究。

4.微型離子選擇性電極及微電極在某些生理現象研究中的應用 近年來，這方面的研究工作特別引人注目。例如有人利用鉑微電極循環伏安法，以抗壞血酸為電化指示劑，研究了腎皮層的滲透功能。有人利用微型鉀離子選擇性電極，通過測定細胞外間隙中K+的濃度變化，研究了中樞神經系統功能正常的情況下，K+作為反饋劑的作用，并由此而了解到K+在人腦病理和危急狀態下的重要作用。在這一方面，特別值得提出的是微型碳纖維電極，在腦化學研究中的應用。采用這種微型碳纖維電極，可以將其植入動物體內進行活體組織的連續測定。監測時間可達一個月之久。利用這種微電極，可以采用各種伏安法測量腦組織中多巴胺及兒茶胺等物質的濃度變化，從而對腦神經的傳導機制等問題，得出了十分有意義的結果。

總之，生物電分析化學的研究內容和方法都是非常豐富的。現有的各種電分析化學技術，在生物體系的研究中都是有用的。不過，將生物學中的一些方法(如免疫法、酶技術等)與電化學結合起來，對于解決生物電分析化學中的問題，可能是更為有效的途徑。在這一方面，伏安免疫法和生物傳感器就是很好的例子。下面我們將著重對這兩種生物電分析方法進行介紹。另外，我們還將簡單地介紹在生物活體組織監測中具有特殊潛力的超微電極。

三 伏安免疫法

免疫法是一種極其重要的生物化學方法。美國的R.S.Yalow因發展肽類激素的放射免疫法而獲得1977年的生理和醫學諾貝爾獎。目前，免疫法已被普遍應用于生物化學研究和臨床病理檢驗。據初步估計，全世界每年要進行幾億次免疫法病理檢驗。由此可見，免疫法的成功，的確是生物化學中一件劃時代的事件。

當一種抗原(antigen，Ag)作用于生物體時，體內的某些器官具有識別這種“異己”的能力，并做出快速反應，產生一種相應的抗體(antibody，Ab)。這種抗體能與抗原形成異常穩定的絡合物，從而消除了抗原的危害。這是生物體賴以生存的本能。

抗體與抗原的反應，不僅具有異常高的穩定性，而且也具有異常高的選擇性。多少年來，分析化學家致力于尋找真正的專屬性試劑，但是否確能實現，仍是一個疑問。然而另一方面，許多抗體與抗原的反應，可以稱得上專屬性反應。據估計，生物體內能產生約107—108種不同性能的抗體，來對付各種各樣抗原的侵襲。這是生物體具有很好的防衛功能的根本原因。

有些抗原只有免疫反應性，而無免疫原性，一般稱為半抗原(hapten)，如分子量較小的雌三醇、嗎啡等藥物等。由于它們也有免疫反應，故也可以用免疫法進行測定。

免疫法是基于抗體與抗原或半抗原之間的高選擇性反應而建立起來的分析方法。它具有很高的選擇性和很低的檢測限，可以應用于測定各種抗原、半抗原或抗體。

免疫法有放射免疫法、熒光免疫法、發光免疫法及酶聯吸附免疫法等。其中以放射免疫法的靈敏度最高。但由于放射免疫法涉及到示蹤原子的處理，在使用上受到限制。

將免疫法的高選擇性與電化學法的高靈敏性結合起來，產生了一種新型的免疫法——電化學免疫法。在電化學免疫法中，最引人注目的是伏安免疫法和免疫傳感器。

實現伏安免疫法的途徑很多。通常按標記方法的不同，分為酶標記法和非酶標記法。采用酶標記法時，通過酶的催化作用，產生一種電活性物質，再用適當的電化學方法進行測量。酶標記法的優點是靈敏度高，因為它利用了酶的催化作用(放大系數103—104以上)。非酶標記法通常利用抗體或抗原本身的電活性，或者通過適當的化學反應進行標記，使其產生電活性，然后再進行電化學測量。非酶標記的方法易于在一般化學實驗室中實現，但靈敏度一般較低。

在上述兩種方法中，根據是否要將抗體-抗原結合物(Ab-Ag)與游離抗體或抗原進行分離而又可將其分為非均相免疫法與均相免疫法。下面舉例加以說明。

1.酶標記伏安免疫法

(1)非均相法 這種方法首先是將抗體固定(惰性吸附或共價鍵合)在聚苯乙烯容器表面上。表面上的空位置用Tween-20結合之。然后將酶標記的抗原(Ag*)和抗原試樣(Ag)加入容器中，讓其與容器表面上有限的抗體進行競爭反應。待一定時間后，洗去游離的抗原。這時，由于競爭反應的結果，與容器表面上抗體相結合的標記抗原量與試樣中的抗原量成反比。然后加入基物，讓其與Ag*中的酶相互作用，得到電活性產物P，最后用伏安法進行檢測。這一過程可用圖1表示。這種方法已成功地應用于強心藥地高辛(digoxin)，免疫球蛋白(IgG)及糖蛋白的測定。

另一種定量方法是形成夾心式化合物的定量法。在這種方法中將抗原試樣加入固定了一定量抗體的容器中，讓抗原與抗體進行反應。達到平衡后，洗去游離的抗原。然后加入另一種酶標記的抗體，使其與抗原再反應，形成夾心式化合物。洗去過量的酶標記抗體，再加入適當的基質S。這時，在酶的催化作用下，基質轉變為具有電活性的P，從而進行測量之。在這種情況下，電信號與被測抗原成正比。這一過程可用圖2表示。這種方法已應用于免疫球蛋白的測定。

采用上述酶標記的非均相伏安免疫法，具有靈敏度高的特點，尤其是這種方法可以將試樣溶液中可能存在的干擾物質(如蛋白質等)分離，提高了方法的適應性;缺點是操作稍復雜。

(2)均相法 這種方法在溶液中進行，不涉及到Ag*或Ag的分離步驟。其基本原理是根據Ag*與Ab反應形成Ab∶Ag*后，它的催化活性相應減小這一現象進行測定的。在這種方法中，被測抗原與一定量的酶標記抗原和抗體在溶液中進行反應，由于競爭反應的結果，一部分Ag*形成了Ab∶Ag*，引起Ag*的催化活性降低，從而減小由基質(S)產生電活性物質(P)的量，據此可以推算出試樣中抗原的含量。這一過程可表示如下：

與非均相法比較起來，均相法比較簡單，但靈敏度較低，干擾因素也較多。這種方法已應用于苯妥英等抗癲癇藥物的測定。

2.非酶標記伏安免疫法

這種方法可能是電分析化學家最感興趣的，因為它不涉及到酶操作技術。在這種方法中，可以直接利用抗體或抗原的電活性，或者通過適當的化學方法，使它們轉變為具有電活性的物質，從而利用免疫反應進行測定。

非酶標記伏安免疫法也可以非均相或均相的方式進行。其基本原理已如上述，茲各舉一例以說明之。

雌三醇是非電活性的，將其硝基化后，即轉變為具有電活性的二硝基雌三醇(Ag*)。它可借微分脈沖極譜進行測定。于溶液中加入雌三醇抗體，形成Ab∶Ag*后，二硝基雌三醇即轉變為非電活性物質。因此，利用這一均相免疫反應，可以測定雌三醇抗體含量。

采用In-DTPA進行標記的人血清蛋白(HSA)的測定屬于非均相免疫伏安法。其基本原理如下：

目前，用于標記抗原的電活性物質還有Hg2+、Pb2+、Co2+、Ni2+、Cd2+以及Brdicka蛋白質的利用等。被測定的抗原或半抗原還有嗎啡、免疫球蛋白、卵蛋白等。我國西北大學胡蔭華等在白喉類毒素等的伏安免疫法測定中取得了好的結果。

四　 生物電化學傳感器

生物電化學傳感器是將生物化學反應能轉換為電信號的一種裝置。重要的生物電化學傳感器有酶傳感器、細菌傳感器、組織傳感器以及免疫傳感器等。

1.酶傳感器 酶傳感器是將對被測底物具有選擇性響應的酶層固定在離子選擇性電極表面上而制成。待測底物是各種有機物。它們在酶的催化作用下，生成或消耗某些能被電極所檢測的催化產物，根據電極對催化產物的響應，即可測得產物的濃度。

血糖和尿糖的檢查，是臨床上常規化驗項目之一。它對于糖尿病的診斷和治療十分重要。用于測定葡萄糖的酶傳感器所基于的生物化學反應是：

葡萄糖+氧氣→葡萄糖酸+過氧化氫

可見氧的消耗量或過氧化氫的生成量，與待測葡萄糖含量有關。所以，通過采用電極法測得過氧化氫的生成量或氧的消耗量之后，就可測得體液中葡萄糖的含量。這種方法可在30秒內得到分析結果。

70年代以來，酶傳感器的研制工作蓬勃興起，傳感器的設計形式不斷翻新，采用的酶的種類日益增多，所測定的物質的范圍越來越廣。在美、日等國，許多酶傳感器已用于臨床，并有部分商品出售。

2.細菌或組織傳感器 酶是從各種細菌和動物組織中分離提取出來的，它們在離開原有的自然環境后，便相當不穩定，極易失去其生物活性，從而導致酶傳感器的使用壽命很短。酶的孔徑約為0.5—1μm，由酶形成細菌或微器官組織之后，其孔徑增大至1—10μm，而形成動植物的活體組織之后，其孔徑更大。由細菌或組織制成的傳感器，其穩定性要好得多，但選擇性不如酶傳感器，因為細菌或組織中可能有多種功能的酶同時存在。

氨基酸的測定，是細菌或組織傳感器的成功應用的一例，其原理如下：

氨基酸擴散至電極表面上的細菌膜或組織膜中，被氨基酸氧化酶催化分解，產生相當量的氨。此氨分子再擴散至電極與生物膜間隙的溶液中，借氨氣敏電極進行測定，由此可求得試液中氨基酸的含量。

與酶傳感器比較，雖然細菌或組織傳感器的使用壽命大大延長，而且可以避免酶的提取和純化過程。但由于待測底物必須首先擴散到細菌或組織中，再通過酶促反應轉換為電極可響應的產物，最后產物才擴散到電極表面進行鑒測。這一過程比較緩慢，因而細菌或組織傳感器的響應時間一般較酶電極為長。

3.免疫傳感器 免疫傳感器是一類能檢測抗原或抗體的傳感器。例如利用碘離子選擇性電極，可以測定乙型肝炎抗原。這是一種酶免疫分析傳感器。制作這種電極時，需要將乙型肝炎抗體固定在碘離子選擇性電極表面的蛋白質膜上。測定時，將此電極插入含有乙型肝炎抗原的溶液中，使抗體與抗原結合，再用過氧化酶標記的免疫球蛋白抗體處理，這時就形成了抗原與抗體的夾心結構：

圖中實線表示共價健結合，虛線表示抗體與抗原間的靜電作用。將此電極插入過氧化氫和碘化物的溶液中，在過氧化酶標記的免疫球蛋白的催化作用下，過氧化氫被還原，而碘化物因被氧化而消耗，碘離子濃度的減少與乙型肝炎抗原的量成正比，由此可推算乙型肝炎抗原的濃度。

另一種有趣的免疫傳感器是離子免疫電極。例如載有特定離子的紅細胞抗原，能與待測抗體結合。這種結合物能被一種稱為補體的酶識別，并使紅細胞溶解，釋放出細胞所載的離子。這些釋放出來的離子可用離子選擇性電極來檢測。

利用這種原理，以羊紅細胞作離子載泡，三甲基苯銨作標記離子，可以測定牛血清蛋白抗體。另外，人造的脂泡也可代替紅細胞進行上述免疫分析。例如：以四苯基銨離子作標記離子，把一種腦代謝的中間產物神經節苷脂連接到脂泡的表面作抗原，以四苯基銨離子選擇性電極作檢測電極，采用薄層電位測量技術，可以測定微升量血清中的神經節苷脂抗體。

應該指出，雖然生物傳感器的研制已取得了很大的進展，但它們距離嗅覺器官、味覺器官那樣的生物感覺系統還相差很遠。因而，制作具有生物感覺系統水平的傳感器，可能是生物傳感器的主要發展目標。

五 超微電極

超微電極簡稱微電極。這種電極的主要特征是其尺寸很小(<100μm)，小于其擴散層的厚度。它有很多特殊優點，故在電分析化學特別是生物電分析化學中具有很大的發展潛力。

設有一平面圓盤電極，其半徑為rθ，則擴散電流為

T

可見擴散電流為時間的函數。它隨時間的增長而減小，直至時間趨近無窮大時，電流達到恒態值(穩態電流)。

一條件，即上式括號中第二項可以忽略，此時電流為穩態電流，其值為

i=4πnFDCr

這樣，用超微電極得到的i-E伏安曲線是S型，而不是峰形。

超微電極表面附近的擴散不是線性擴散，而是非線性擴散。超微電極表面有一種極重要的效應，稱為邊緣效應。邊緣效應的大小用σ表示，

式中v為電壓掃描速度。當r0→∞時，σ等于0，此時為線性擴散，為普通的圓盤電極。當σ>103時，邊緣效應相當明顯，為超微電極。

由于超微電極的表面積很小，故相應的各類電流的絕對值很小，因此，電解池的iR降常小到可以忽略。這樣，它就可以應用于高電阻的溶液，如某些有機溶劑及基本上不加支持電解質的純水溶液等。在這種情況下，通常為消除iR降而設計的三電極體系就可用簡單的兩電極體系代替。這種情況對生物體系的測定極為有利，因為它基本上可以實現無破損分析，也不會引起明顯的排他性反應。但是，由于電流的絕對值太小，常小于10-9A，故要用pA級電流計進行測量。

超微電極的種類很多，對于生物體系來說，應用最多的是碳纖維電極。超微鉑、金、汞等電極在其他許多情況中也用。超微電極有盤、環、球、筒等各種形式。若將多個電極組裝在一起，成為一個組合電極，則電訊號增大很多，這對于實際應用當然是很有利的。應該指出的是，超微電極由于制造工藝上的困難而限制了它們的應用。

超息電極在電化學及電分析化學中已有許多應用，如研究快速電極反應及電沉積機理等。在生物電分析化學中，超微電極主要應用于活體組織的分析，如血液中O2的連續測定，大腦神經傳導過程中多巴胺等物質的測定，體內抗壞血酸濃度的監測等。

化學修飾超微電極可能是一種更為理想的生物電分析化學檢測器，因為它可以消除許多生物物質的干擾，提高方法的選擇性。例如用Nafion膜修飾的超微碳纖維電極，在測定活體組織中兒茶胺等神經傳導質的應用中，取得了很好的結果。

總之，生物電分析化學是一門新興的引人入勝的學科。盡管目前這方面的工作不是光彩奪目，但確實已經取得了令人振奮的結果。