lncRNAH19作為ceRNA通過調控RNAmiR-29b-3p來調節膀胱癌細胞上皮間質轉化和轉移

上一篇 / 下一篇 2017-12-28 11:44:48/ 個人分類：非編碼RNA研究

文獻：lncRNA H19 regulates epithelial–mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer by miR-29b-3p as competing endogenous RNA. Biochim Biophys Acta（IF6.261）

關鍵技術：

1、病毒轉染（慢病毒包裝、腺病毒包裝）

2、分子互作技術（Pull down、RIP（MS2/Ago）、雙熒光素酶實驗）

3、檢測分析（免疫組化、克隆形成、細胞劃痕愈合、CCK8、EdU、HE染色、WB、ELISA、q-PCR）

4、分子定位技術（FISH、IHC、免疫熒光、激光共聚焦）

5、芯片技術（lncRNA/mRNA芯片）

長鏈非編碼RNAH19作為內源競爭性RNA通過調控RNAmiR-29b-3p來調節膀胱癌細胞上皮間質轉化和轉移

研究背景

　　EMT(epithelial-to-mesenchymal transition)主要在腫瘤侵襲和轉移中發揮作用，其改變主要表現在分子、細胞、組織水平，涉及組織細胞形態改變、組織特異分子表達的改變。通過檢測相關分子表達水平或細胞形態改變可以評估腫瘤進展、了解藥物療效及基因功能作用。lncRNA（long noncoding RNAs）與腫瘤的發生發展關系密切，越來越多的研究表明，lncRNA可以調控腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡、分化進而調控腫瘤的發生發展。

　　本文以膀胱癌和腫瘤侵襲為研究對象，聚焦EMT過程和lncRNA功能機制，以lncRNA調控EMT機制為主線，綜合運用芯片、生物信息學分析、分子互作技術（RIP、RNA pulldown、雙熒光素酶）、分子定位（免疫熒光、FISH）等技術研究了lncRNA的下游互作分子，探討了H19（lncRNA）功能機制。構建了H19調控膀胱癌侵襲、轉移的作用軸線（如下圖）。

研究內容及結果

1、臨床研究水平，研究了正常人和病人H19和DNMT3B的表達水平和相關性。

2、體外實驗，尋找并綜合運用多種技術手段驗證了H19的相互作用靶分子miR-29b-3p及miR-29b-3p的相互作用靶分子DNMT3B

3、體內實驗，運用裸鼠成瘤實驗驗證了H19對腫瘤侵襲轉移的作用。

一、臨床研究水平

　　研究了癌組織和癌旁組織以及膀胱癌細胞系中H19和DNMT3B的表達水平和相關性。發現H19和DNMT3B在癌組織中高表達而在癌旁組織中低表達。運用pearson correlation分析發現H19和DNMT3B的高表達具有正相關性。這暗示了H19對DNMT3B可能具有正調控關系。這是后面作者進行生物信息學預測和機制功能研究的基礎。

1、作者首先統計了臨床上H19的表達和膀胱癌患者性別、年齡、腫瘤病理分期、淋巴轉移的關系。發現高表達的H19和膀胱癌的分期和淋巴轉移存在密切關系（P<0.05）。

2、運用芯片和q-PCR研究了H19和DNMT3B在膀胱癌和癌旁組織中的表達水平。芯片技術發現H19和DNMT3B在腫瘤組織中均高表達，而在癌旁組織中低表達，芯片的結果得到了q-PCR的驗證。

3、Pearson correlation分析發現H19和DNMT3B的高表達具有正相關性，說明H19對DNMT3B的表達可能具有正調控作用，如果H19作為ceRNA，則可能存在miRNA來受lncRNA的調節來調控DNMT3B。

4、在組織水平之外，作者也研究了常用的幾種膀胱癌細胞系中的H19表達水平，發現在常用的幾種癌細胞系中H19均高表達。

二、體外實驗

　　臨床實驗證實了H19與膀胱癌的分期、轉移有密切的關系，同時H19和DNMT3B可能存在正調控關系。作者綜合運用多種功能實驗研究了H19的體外功能，在此基礎上然后運用生物信息學分析方法和多種互作技術預測并且驗證了H19的互作分子miR-29b-3p和下游調控靶分子DNMT3B。

1、功能研究。作者綜合運用CCK8、EdU、克隆形成、劃痕愈合、Transwell、免疫熒光等技術對H19的生物學功能進行了研究，發現H19可以促進癌細胞的增殖、侵襲、遷移、轉移和細胞骨架重構。

2、機制研究。生物學預測發現H19和DNMT3B都可以與miR-29b-3p結合。雙熒光素酶證實H19、DNMT3B可以與miR-29b-3p直接結合。FISH實驗可以發現H19和miR-29b-3p在細胞內存在共定位。GFP-MS2-RIP和RNA-pulldown實驗驗證了H19可以內源性結合miR-29b-3p。Anti-AGO2 RIP進一步驗證了H19可以通過AGO2與miR-29b-3p結合。而H19、DNMT3B和miR-29b-3p的三因子雙熒光素酶實驗最終確認三者的ceRNA調控網絡。

三、體內實驗

　　在幾個膀胱癌細胞系的體外機制研究表明，H19與miR-29b、miR-29b與DNMT3B之間存在調控關系，H19作為ceRNA可以通過直接調控miR-29b來調控DNMT3B的表達，進而調控下游相關分子的表達和EMT相關功能的實現。接著作者用裸鼠成瘤實驗驗證了H19、miR-29b對膀胱癌細胞成瘤能力、轉移能力、血管形成的影響。

文章總結

　　作者從臨床案例入手發現了膀胱癌與H19表達關系，然后運用芯片技術和q-PCR進一步驗證了膀胱癌中H19和DNMT3B存在正相關關系，生物信息學分析預測了由miR-29b調控DNMT3B表達的ceRNA網絡關系。體外實驗中，互作分子技術（雙熒光素酶實驗、RIP、RNA pulldown）驗證了生物信息學的預測，功能實驗驗證了H19、miR-29b和DNMT3B三種在細胞增殖、侵襲、遷移、EMT轉化中的作用和相互作用關系。接著作者進一步開展了體內實驗，裸鼠成瘤實驗證實了H19可以促進膀胱癌細胞的增殖、淋巴轉移、血管生成。這樣作者從臨床、體外、體內三個水平探究了作為ceRNA的lncRNA（H19）在調控膀胱癌細胞侵襲轉移EMT轉化中的調控網絡，描繪了H19/miR-29b/DNMT3B調控主線。

本文采取病毒包裝、分子互作（Pull down、RIP、雙熒光素酶實驗）、檢測分析（免疫組化、WB、q-PCR）、分子定位（FISH、IHC、IF）、lncRNA/mRNA芯片等方法，研究lncRNAH19通過調控miR-29b-3p調節膀胱癌細胞上皮間質轉化和轉移機制。文獻全文索取、技術服務溝通可隨時@qq3268908524......

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