lncRNA研究之RNA pull-down問答集錦

　　新開通了博客，說是寫點東西，剛好最近在學習理解非編碼RNA相關技術，簡單梳理了RNA pull down實驗中遇到的問題，可能不夠全面，也希望群友們給些建議，互相交流。

　　長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類不編碼蛋白的RNA分子，長度在200bp以上；研究表明，lncRNA具有保守的二級結構，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學過程的調控。隨著高通量測序技術的發展，越來越多的lncRNA被注釋，但是絕大多數的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常廣闊的未知領域，具有極大的科研價值和意義。其中RNA Pull-down技術為lncRNA生物學功能的驗證起到了至關重要的作用。

　　RNA Pull-down結合了體外轉錄與生物素標記、質譜技術，是研究非編碼RNA與蛋白質相互作用的一大利器。由于實驗程序較多、RNA的易降解性，加上一些不可預知的變量，因此實驗存在一些難度，常常導致實驗的失敗。對于試驗中常常出現的棘手的問題，http://http://www.genecreate.cn/RNA_pull_down/經過實踐，總結了一套行之有效的應對方策，現在一起來看看吧！
1、RNA Pull-down拉下蛋白PAGE電泳銀染條帶顏色淺且模糊？

    ①選取的組織或細胞樣品其中互作蛋白表達量很低；

　　②體外轉錄得到的RNA降解或者不是全長；

　　③Pull-down實驗孵育時間不長；

　　④其他

2、PAGE電泳銀染背景深？

　　①樣品雜蛋白太多；

　　②銀染顯色時間過長；

　　③其他
3、RNA Pull-down拉下蛋白銀染后看不到互作蛋白：

　　①選取的RNA序列不對；

　　②樣品中沒有表達互作的蛋白質；

　　③互作蛋白濃度低，銀染圖肉眼觀察不到差異條帶；

　　④其他

　　①lncRNA序列前期驗證要完善；

　　②選擇相應蛋白質表達量較高的組織或細胞樣品；

　　③體外轉錄選擇轉錄質量高的試劑盒，操作過程避免Rnase的污染；

　　④保證RNA Pull-down實驗中探針標記以及探針與蛋白的結合充分進行（依據體外轉錄RNA的量，樣品裂解液蛋白濃度）；

　　⑤盡可能多將洗脫的蛋白電泳（同時可以避免顯色時間過長）

　　其他原因，歡迎交流！如果您在RNA Pull-down實驗中遇到困惑，可以隨時@qq3268908524，下期我們再通過解讀一篇文獻中MS2 RIP、RNA Pull-down的技術應用，進一步探討，再見！