柱色譜-紫外分光光度法測定廣金錢草中總黃酮的含量

作者:楊美華，盧兗偉，匡巖巍，孫仲詒，吳祖澤

摘 要：目的 建立廣金錢草中總黃酮的含量測定方法。方法 選用測定波長272 nm，以6-C-葡萄糖-8-C-木糖洋芹素(vicenin-2)為對照品，采用柱色譜-紫外分光光度法對不同來源的廣金錢草進行了總黃酮的含量測定。結果vicenin-2在10.8～25.2μg/mL具有良好的線性關系，回歸方程為Y=0.0309 X+0.016(r=0.9999)，平均回收率為100.82%，RSD為1.3O%。結論 該方法操作簡便，結果準確，重復性好，可用于廣金錢草的質量控制。

Quantitative determination of total flavonoids in Desmodium styraci folium by column chromatogram-UV spectrophotometry

Key words：Desmodium styracifolium (Osbeck)Merr.;vicenin-2;total flavonoids;quantitative determination：column chromatogram-UV spectrophotomatry

廣金錢草為常用中藥，來源于豆科山螞蝗屬植物金錢草Desmodium styracifolium (Osbeck)Merr.的干燥地上部分，收載于《中華人民共和國藥典》2000年版一部 。具有清熱除濕，利尿通淋之功效。含有黃酮類、皂苷類、鞣質和生物堿等成分。藥理研究證明，廣金錢草總黃酮具有預防草酸鈣結石形成和復發的作用，另外還有顯著的抗炎作用，增加冠脈血流量等。《中華人民共和國藥典》只收載了廣金錢草中黃酮、生物堿的定性檢查方法。本實驗首次以黃酮中含量較高的成分6-C-葡萄糖-8-C-木糖洋芹素(vicenin-2)為對照品，采用柱色譜-紫外分光光度法，測定了廣金錢草中總黃酮的含量，為廣金錢草原藥材的質量控制提供了依據。

1 儀器與試藥

UV-2501PC (島津)UV-Vis光譜記錄儀，TP-300超聲波清洗機。

vicenin-2對照品自制，采用自身對照HPLC法測得含量為98%以上。所用試劑均為分析純。柱色譜用聚酰胺(60～90目)(江蘇臨江試劑廠)。

廣金錢草藥材購于海南省、廣東省和廣西省不同的藥房和醫藥公司。經北京大學藥學院陳虎彪教授鑒定為豆科山螞蝗屬植物D.styracifolium(Osbeck)Merr.的干燥地上部分。

2 方法與結果

2.1 測定波長的選擇：對照品溶液和供試品溶液(上柱前及上柱后)在200～400nm 進行掃描，發現均在272及339 nm附近有最大吸收峰，但波長272nm處的響應值比波長339nm波長處的響應值大，故選擇測定波長272nm。

2.2 對照品溶液的制備：精密稱取經五氧化二磷干燥24h的vicenin-2對照品適量，加50%乙醇制成36μg/mL的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備：取本品粉末(過二號篩)0.5g(同時另取本品測定水分)，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加80%乙醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率440W ，頻率50Hz)60min，取出，放冷，再稱定質量，用80%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5mL，蒸至近干，殘渣加50%乙醇使溶解，放冷，通過聚酰胺柱(60～90目，1g，內徑1cm，濕法裝柱)，以50%乙醇洗脫，收集洗脫液并定容至100mL，搖勻，作為供試品溶液。樣品含量均以干燥品計算。

2.4 線性關系考察：精密吸取上述對照品溶液3，4，5，6，7 mL分別置于10 mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，以50%乙醇為空白對照，于272nm 處測定吸光度，以vicenin-2溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，計算得回歸方程為：Y=0.0309X+0.016，r=0.9999。結果表明vicenin-2在10.8～25.2μg/mL與吸光度具有良好的線性關系。

2.5 精密度試驗：取一定濃度供試品溶液連續測定5次，測定吸光度，其RSD值為0.38%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗：取對照品及供試品溶液于室溫分別放置0，30，60，90，120min測定吸光度，計算對照品及供試品的RSD分別為1.20%，0.74%。表明對照品及供試品溶液在2h內穩定。

2.7 重復性試驗：精密稱取同批樣品5份，按含量測定方法進行測定，平均含量為2.24%，RSD為1.70%，表明重現性良好。

2.8 回收率試驗：精密稱取已知含量的廣金錢草藥材(過二號篩)5份，分別精密加入vicenin-2對照品適量，各份均按含量測定方法進行測定，平均回收率100.82%，RSD 1.30%(n=5)。

2.9 樣品測定：按2.3項制備供試品溶液，對11批來源不同的廣金錢草進行了總黃酮的含量測定。

3 討論

3.1 測定方法的選擇：黃酮類化合物含量測定方法有比色法、紫外分光法等。很多文獻報道總黃酮的含量測定均以蘆丁為對照品，采用NaNO2A1(NO3)3-NaOH為顯色劑進行含量測定。郭亞健等選擇了一些黃酮類成分和非黃酮類成分，照上述比色法在波長400～700nm 進行掃描測定。結果表明，有些黃酮類物質在500nm 處無最大吸收或吸收很弱，而有些非黃酮類物質在500nm處有最大吸收或有較強吸收。實驗結果說明以蘆丁為對照品，以NaNO 2-A1(NO3)3-NaOH 為顯色劑，于500nm進行總黃酮含量測定的方法專屬性不強，有局限性，準確性較差。石淋通片系廣金錢草的浸膏片，席先蓉等曾參照《中華人民共和國藥典》測定槐花中蘆丁含量方法，以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH為顯色劑，對石淋通片中黃酮類化合物的含量進行了測定。結果未見供試品溶液在500或510nm 處與對照品有相似吸收峰，顯然用該法測定石淋通片中總黃酮的含量是不妥的。筆者也曾采用上述方法，以蘆丁為對照品，對廣金錢草原藥材進行總黃酮的含量測定，實驗結果與席先蓉等一致。此外，還以vicenin-2為對照品，以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH為顯色劑，采用上述方法，對廣金錢草中總黃酮的含量進行了測定，結果仍未見對照品溶液和樣品溶液在500或510nm處有吸收峰，該結果亦表明以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH為顯色劑的比色法不能用于廣金錢草中總黃酮的含量測定。從實驗結果可知，以廣金錢草黃酮中含量較高的成分vicenin-2為對照品，采用柱色譜-紫外分光光度法測定其總黃酮的含量，操作簡便，重現性好，結果準確。

3.2 提取溶劑和提取方法的選擇：實驗中比較了50%甲醇，30%甲醇，80%乙醇超聲提取或加熱回流提取樣品，結果以80%乙醇超聲提取的樣品雜質量少，操作簡便。

3.3 提取時間的確定：采用80%乙醇超聲提取樣品，分別測定了不同提取時間樣品中總黃酮的含量，結果在以60min時總黃酮含量最高。

3.4 洗脫溶劑和體積的確定：實驗中曾采用甲醇5%～30%，乙醇10%～50%洗脫，結果以50%乙醇75mL 即可洗脫完全。

3.5 本方法簡便快速，準確度高，重現性好，為《中華人民共和國藥典》廣金錢草的質量標準的進一步提高提供了依據。

References：

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