摘要：介紹了一種雙波長分光光度法，應用于測定油菜蜂花粉中的總黃酮含量，測定波長510nm，參比波長584nm，平均回收率98.2%，RSD=1.23%(n=5).結果表明，青海產油菜蜂花粉中總黃酮平均含量為3.22%，該方法穩定可靠.重現性好.
油菜(Brassica campestris L.)為十字花科，蕓苔屬植物.由蜜蜂采集的油菜花粉——蜂花粉，包含了花蜜和蜜蜂的唾液，富含包括黃酮類物質在內的多種營養成分，在營養、保健、化妝品、醫療等領域得到廣泛的應用.人們對油菜蜂花粉中的氨基酸、蛋白質、維生素、礦物質、脂肪酸、碳水化合物等的研究較多，而對同樣具有較高保健、藥用功效的黃酮類物質的研究非常缺乏.關于黃酮類物質的定量，一般常采用比色法和HPLC法。HPLC法儀器昂貴，而且標準對照物不易獲得，其應用受到一定的限制。比色法方便簡單，用于組成單一的標準對照物時，結果準確，但當應用于組成復雜的植物試樣時，比如花粉黃酮提取液，由于受到多種物質的干擾，而且底液常常出現混濁現象，因此測定結果明顯偏高。為克眼底液強吸收帶來的干擾，本文采用雙波長分光光度法，分析測定青海產油菜蜂花粉中的總黃酮含量，取得了滿意的實驗結果，可為油菜蜂花粉資源的綜合開發利用提供科學依據。
1 實驗部分
1.1 實驗材料、試劑與儀器
油菜蜂花粉購自青海省湟中縣，家用食品粉碎機粉碎、自然干燥后備用。
蘆丁標準對照品溶液，精密稱取105℃干燥至恒重的蘆丁(中國藥品生物制品檢定所)27.90mg，95%乙醇溶解、定容l00mL;其它試劑均為分析純。
UV265型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)。
1.2 花粉總黃酮的提取
通過預試驗，發現水提法得到的黃酮量極少，采用醇提法，當乙醇的濃度為95%時，花粉黃酮的提取率最高。所以決定以95%，乙醇為溶劑，采用索氏提取器提取。稱取花粉3.000 g，用濾紙包好.放入索氏提取器中，首先加入石油醚，水浴加熱回流，脫脂、除蠟，至回流液無色時，分離出石油醚棄去。加入95%乙醇，水浴加熱回流12h，抽濾，以95%乙醇洗滌殘渣，合并濾液，定容100mL，得花粉總黃酮提取液(試液).
1.3 分析方法
1.3.1顯色方法
采用NaN02-Al(NO3)3-NaOH顯色體系進行顯色分析，分別精密吸取不同量的對照品溶液或試液至25mL容量瓶中，用30%的乙醇稀釋至12.5 mL;加入0.7 mL5%NaNO2溶液搖勻，放置5min;加入0.7mL10%Al(NO3)3溶液搖勻，放置6min;加入1mol/L NaOH溶液5mL混勻，以30%的乙醇定容，放置10min;以試劑空白為參比溶液，分別在不同的波長下測定其吸光度.
1.3.2 測定波長和參比波長的選擇
分別吸取2.5mL對照品溶液和0.5mL試液，按1.3.1方法顯色。在400-700nm范圍內進行光譜掃描，得到吸收光譜圖。在雙波長分光光度法測定單組份時，可以選用顯色絡合物的最大吸收波長作為測定波長，而吸收光譜下端某一點的波長可選作參比波長，因此，選擇510nm作為測定花粉總黃酮含量的測定波長，584nm為參比波長。
2 結果與討論
2.1 標準曲線的繪制
2.2 回收率試驗
2.3 樣品測定
精密吸取1.0 mL的花粉黃酮提取試液，按1.3中的方法顯色、測定吸光度，由標準曲線計算樣品中的總黃酮含量.同時以510 nm為測定波長，進行單波長比色法對比分析.取油菜蜂花粉平行5次總黃酮提取、測定實驗，總黃酮含量及測量精密度實驗結果。
2.4 討論
油菜蜂花粉中的總黃酮含量，雙波長法的測定結果3.22%明顯比單波長測定結果3.67%要低，其主要原因是花粉黃酮提取液在顯色分析過程中易出現底液輕度混濁現象，從而造成單波長法的測定結果要高.我們曾想通過以不加顯色試劑的試液為空白來進行校正，但由于在加入NaOH溶液后底液混濁現象有明顯改善，與試液空白根本不一致， 這樣做引起的誤差更大.而雙波長法能很好地扣除底液混濁等背景干擾，結果準確，精密度好，實驗操作簡單方便.
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