定量PCR除可以對樣品的初始濃度進行準確定量外，還有其它多種豐富的應用。還包括基因表達調控情況的分析、等位基因的分析等，那么這些功能是如何在一臺定量PCR儀上實現的呢?下面將進行一一介紹。
利用標準曲線對樣品的初始濃度進行定量：
用已知濃度的標準品繪制標準曲線來對未知樣品定量，首先要有一組穩定的標準品。標準品可以是含有目的基因的線性化的質粒DNA，也可以是比擴增片段長的純化后的PCR產物，當然也可以是DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作為標準品的核酸都必需保證穩定。一般一條標準曲線取四到五個點，濃度范圍要能覆蓋樣品的濃度區間，以保證定量的準確性。一般一個點重復三至五次，對于常期穩定使用的標準品可以適當減少重復的次數。
以Rotor-Gene3000的操作為例，以標準曲線對未知樣品定量是默認的分析方法。軟件可在反應尚在進行時就對結果進行分析，結果隨著反應的進行可實時更新，當然也可以等反應完全結束后再進行分析。
點示“Analysis”，彈出分析框，默認分析功能即為“Quantitation”，點擊“Show”，軟件即自動給出包括標準曲線(包括R值，R平方值，擴增效率、標準曲線公式等)、標準化的熒光曲線、各樣品計算濃度(包括標準偏差、變異系數等)在內的結果。
若是使用SYBR Green I法，還可進行熔解曲線分析，以判斷退火溫度是否合適，產物中是否有引物二聚體的影響。對于SYBR Green I的客戶，我們建議一定要在最后做一步熔解曲線的分析，這對于反應條件的優化和結果的正確判定都有著非常重要的作用。
同樣，點擊“Analysis”，在分析窗口中選擇“Melt”，點擊“Show”，自動給出分析結果。
完成了所需的分析之后，如還需給出分析結果報告，點擊“Analysis”邊上的“Report”選項，選擇報告模板，軟件自動給出報告。
利用定量技術進行基因型分析研究：
常用的分析方法有兩種，一種是Taqman探針法，一種為FRET探針法(又稱Hyb探針)，運用以上兩種方法進行基因型的分析需要一臺有多通道的熒光定量PCR儀。Taqman探針分析基因型是以擴增信號的有無來判定，而FRET探針則根據擴增后片段熔解溫度的不同來判定。
以下為用Taqman探針判斷基因型的實例：
這里，突變型的探針以FAM熒光素標記，野生型的探針以VIC熒光素標記，檢測時分別同時檢測了FAM通道和VIC通道的熒光情況。這里，3、4號樣品只在FAM通道有信號，而在VIC通道里無信號，表明這兩個樣品為突變型;1、2號樣品在FAM通道無信號，在VIC通道有信號，表明這兩個樣品為野生型;而5、6號樣品在兩個通道都有信號，但熒光強度恰為其它樣品的一半，說明這兩個樣品為雜合型。
并且，我們可以在軟件里將不同的通道定義為不同的基因型，軟件會根據不同樣品在各個通道的熒光情況，自動對各個樣品的基因型做出判定。
以下為用FRET方法分析基因型的實例：
如上圖，熒光探針與突變型完全匹配，而與野生型存在一個堿基的錯配，因而打開這兩組雙鏈所需的能量就不同，具體體現在熔解溫度的差異上，因而突變型的樣本有較高的熔解溫度，而野生型的樣品熔解溫度相對較低。在圖中，5號樣本熔解溫度較低，為野生型;2號樣本熔解溫度較高，為突變型;而1、3、4號樣品在高溫和低溫處都出現了熔解峰，則它們為雜合型。并且用戶還可以將不同的峰定義為不同的基因型，軟件可根據用戶的定義自動給出未知樣品的基因型。如上圖表格中所示。
利用相對定量的方法分析目的基因的上下調情況：
基因表達調控研究中，常用的相對定量方法主要有兩種，Delta-deltaCt法和雙標準曲線法。由于RNA純化后得率不同、RNA反轉錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，因此，在進行基因表達調控研究中都會用一些看家基因來標準化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表達調控分析時至少要做兩個基因，目的基因和一個看家基因。我們分別來看看以上兩種相對定量分析方法的特點和應用。
Delta-deltaCt：
公式：
由Delta-delta Ct的公式可以看出，該方法直接利用看家基因來校正樣品初始量，但同時默認兩個基因擴增效率一致。
Comparative Delta-delta Ct法的特點、注意事項及實際應用：
1. Comparative Delta-delta Ct法的一大特點是，當優化的體系已經建立后，在每次實驗中無需再對看家基因和目的基因做標準曲線，而只需對待測樣品分別進行PCR擴增即可。
2. 每次實驗都默認目的基因和看家基因的擴增效率一致，而并非真實擴增情況的反映，因此實驗條件需要嚴格優化，并且總會存一定的偏差。
用Comparative Delta-delta Ct法展開定量實驗前，在預實驗中，必需對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。Rotor-Gene 的軟件會自動給出兩組標準曲線的R值、擴增效率等信息，如果兩組標準曲線的斜率，即M值的差小于0.1，表明兩個基因的擴增效率已非常接近，那么后續實驗中就可以用Comparative Delta-delta Ct法進行相對定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就無法用該方法進行相對定量分析。此時的解決方法有兩種，一是優化實驗，使兩組標準曲線的斜率差值小于0.1，二是換用其它的相對定量方法。
下面是某科研用戶用Delta-delta Ct進行相對定量分析的實例：
首先，該客戶分別做了目的基因和看家基因的確標準曲線，根據軟件自動給出的M值判斷該方法的可行性：
如下圖，將標準品進行梯度稀釋后，分別對目的基因(Gene of Interest)和看家基因(Housekeeper Gene)做標準曲線。軟件自動繪制標準曲線，并給出相應的參數。從上圖可知，兩組標準曲線的M值分別為-3.525和-3.467，兩者的差值<0.1，因此，這組看家基因和目的基因可以用Comparative Delta-delta Ct法進行相對定量。
確定這兩個基因可以用Delta-delta Ct法分析后，用戶擴增了其待測樣品的目的基因和看家基因。經軟件自動分析后，給出分析結果，如下：
我們看到，在該客戶的實驗中，以樣品A為對照組，軟件自動組出了樣品B和C的目的基因相對于樣品A的表達情況。 這種方法對于樣品量大，但研究的基因數目相對較少的客戶特別有用，因為一旦條件優化好之后就無需再做標準曲線，節約了試劑和樣品量，實驗操作也相對簡單。
雙標準曲線法：
公式：
雙標準曲線法考慮到了不同基因擴增效率的差異，用標準曲線來校正擴增效率。
雙標準曲線法的特點、注意事項及實際應用：
1. 雙標準曲線法做相對定量分析的最大特點是，應用簡便，無需像Delta-delta CT法那樣對實驗進行嚴格的優化。
2. 其不足之處是每次實驗都必需對目的基因和看家基因做兩組標準曲線。
并且，如果用于做標準曲線的標準品不同于樣品，比如標準品為質粒或純化的PCR產物，而待測樣品為cDNA，那么標準曲線的擴增效率并不能真實地反映樣品的擴增情況，因此以標準曲線來計算樣品的實際濃度就存在一定誤差。
每種相對定量方法都會有一定的局限性，對于雙標準曲線法，比較適合于樣本量不大，但研究的基因較多的客戶，這樣對不同基因條件優化相對Delta-delta Ct法更為簡單。
下面是某科研用戶用雙標準曲線法進行相對定量分析的實例。
要用該方法進行分析，客戶在一輪反應中，對目的基因和看家基因分別做了一組標準曲線，同時也分別擴增的待測樣品的目的基因和看家基因。
如下圖，選擇軟件中相應的分析方法。
軟件自動給出分析結果：
同樣，結果自動給出了待測樣品相對于對照組目的基因的表達情況。
比較定量法：
另一種相對定量分析方法叫比較定量法(ComparativeQuantitation)，該方法在結果驗證中的應用相對較多。
比較定量法的特點、注意事項及實際應用：
1.必需確定起始樣品的總核酸濃度一致。在驗證時使用較多，但同樣也必需有起始濃度一致的核酸樣品。
2.作為常規的基因表達調控研究，建議研究者使用前兩種定量方法。
3.該方法通過拐點時的循環數來進行相對定量比較，重復性更好。
4.該方法操作非常簡便，無需做標準曲線及設置內參。使用時，樣品均定義為unknown，分析時選用ComparativeQuantitation，確定對照組，完成分析。
應用實例：
用Comparative Quantitation法進行定量分析時，在保證起始總核酸量一致的前提下，只要對目的基因進行擴增即可，例：待測樣品A、B、C，擴增目的基因。在軟件中選擇相應方法，即得以下結果：
上圖左下方即相對表達量的結果，其中Rep.Conc為樣品B、C相對于對照組A的目的基因濃度。右側，可通過修改Calibrator Replicate改變對照組，以獲得不同的比較結果。
