實時定量PCR完全手冊

方法簡介
所謂的實時熒光定量 PCR 就是 通過對 PCR 擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 PCR 反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著 PCR 反應的進行，PCR 反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。

RT-qPCR是由三個步驟組成:
1.反轉錄:依賴反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNDA;
2.擴增:用PCR的方法擴增cDNA;
3.檢測:實時檢測和定量擴增的產物.

RT-qRCR影響分析可靠性關鍵點(Key porint):
1.分析結果依賴于模板的數量、質量以及合理的檢測方法設計
2.反轉錄反應的非標準化影響試驗的穩定性
3.數據分析應該高度客觀，如果不合理的分析，從分析結果中會得到混淆的錯誤結果，因此通過對RT-qPCR的每一組分進行質量評價以達到最小化變異性，最大化可重復性，而且還需要沿用一個通用的數據分析的指南。對基因表達分析的標準化的需要是與人類臨床診斷分析相適應的。

存在的問題
由于各個學術團體和科研機構使用不同的操作流程，必然導致大家使用不同定量的來源物以及數據分析：
1.新鮮、冰凍、甲醛固定的樣品
2.整個組織樣本，顯微切割樣本，單個細胞，組培細胞
3.總RNA或者mRNA
4.RNA反轉錄成cDNA的不同的引發策略
5.不同的酶以及酶的不同組合
6.變異系數、靈敏度
7.多類型的檢測化學方法，反應的條件，熱循環儀的分析以及匯報方式。
8.每一步驟缺乏標準化分析流程造成了在樣品的處理，內參的使用，歸一化的方法，質量控制等等因素嚴重影響RT-qPCR的可信度，重復性。

RNA 質量評價
現在RNA 定量的程序很多。最近EMBO qPCR course (http://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28) 比較了用Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 來定量同樣的樣品。結果顯示沒有哪兩種方法得到同樣的分析數據。所以用不同的方法進行定量是不明智的。因此，我們需要用統一套定量分析方法來完成所有RNA樣品的評價。

RNA 質量
RNA 質量主要包括RNA的純度（沒有蛋白質和DNA的污染）以及完整性。傳統的RNA質量的評價通過分析A260/A280的比值或者對瓊脂糖凝膠電泳rRNA的條帶的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流體毛細電泳系統也是一種較新的分析方法。Agilent的2100也是一種十分好的分析RNA質量的方法，它通過分析18S以及28S rRNA的分析圖譜，通過圖譜來反應RNA的量和完整性，其完整性通過完整性系數（RIN）來反應。樣品的RINs在10-4之間。10代表完整的RNA，4代表沒有完整的rRNA帶。
由于以上的方法并非100％準確定反應mRNA的完整性，因為他們只是反應rRNA的量來間接測定mRNA的完整性。這里推薦一種方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。

我們使用oligo dT進行逆轉錄，然后對逆轉錄的cDNA用multiplex熒光定量評價。設計三個taqman探針來定量三種相同大小的擴增產物。探針設計的位點分別位于3’;5’以及中部。擴增產物的之間的比值反應RNA的完整性。如果3’;5’的比值在1,反應較高度完整性，如果高于5說明降解。

QRT-PCR 抑制物的組成
QRT-PCR抑制物嚴重減少了PCR的靈敏度以及熱動力學反應,高度的抑制還導致假陰性的結果。
抑制物的來源：生物樣品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，鹽離子，尿素，血紅素，heparin以及IgG.
是否有抑制物的評價體系：
1.通過對目的樣品進行梯度稀釋進行PCR擴增效率的檢測
2.通過內部擴增對照來反應樣品處理過程中樣本的情況
3.用細菌檢測臨床樣品的抑制
4.通過標準人工合成的擴增進行RT-PCR來反應目標檢測物的抑制情況

反轉錄反應系統
1.RT和PCR單一酶系統
2.RT和PCR分離的酶系統
3.RNA逆轉錄引物的選擇
引物主要有三種：
1.隨機引物：隨機引物，特別是6nt引物對所有的靶位點不產生十分穩定一致的結果，建議使用15nt的隨機引物.
2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的樣品，特別有polyA .而且對于一些特殊的變異體以及較長的3’UTR的區域比較困難
3.特異引物：最特異最靈敏的方法。特別RNA量足夠情況下建議使用此法。

PCR 優化
PCR優化主要有：
1.引物的濃度
2.建議使用SYBR Green I和EvaGreen 進行擴增和溶解曲線的測試

筆者建議的操作流程:
I．靶的選擇和試驗設計
1.針對目的基因序列選擇合適的擴增片斷
查看以下三個網站是否有合適的已經證實的QRT-PCR的擴增引物,探針以及反應條件.
RTPrimerDB (http://medgen.ugent.be/rtprimerdb),
PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html)
Real Time PCR Primer Sets (http://www.realtimeprimers.org)
如果沒有合適的或者已經證實的可以提供參考,以下的設計方案僅供參考:
A.最廣泛使用的商業化的軟件Beacon Designer(http://www.premierbiosoft.com)
B.DIY的軟件Primer Express
C.如果Beacon Designer 無法得到您說需要的結果,或者獲得到設計方案的備選數目不夠的話,可以選擇Sigma-Genosys http://www.designmyprobe.com)的服務方案,詳細周到
D.一個免費的基于網頁構架的引物和探針設計程序: http://www.biosearchtech.com/products/probe_design.asp
您可以挑選其中的4-6對引物進行試驗,選擇引物的擴增效率和靈敏度高的.這個軟件可以直接與NCBI的網站進行比對,并且用NCBI的ePCR進行虛擬的電子PCR

引物設計簡介
DNA引物長度:15-25 個堿基
GC含量:50%左右
如果引物的與AT區域富集結合,可以考慮用LNA替換幾個堿基,較少引物的長度以及避免引物次級結構和3’端二聚體的影響.由于引物和模板和探針與靶點之間的分之間的相互競爭,分之內雜交,倒轉重復等等會引起引物的引發探針對結合效率達降低,因此我們選擇引物二聚體的△G為負值,即:<10 kcal/mol.沒有連續的G/C.
引物探針的保存一般遵循以下原則:
正向和反向引物保存在-20度, 濃度為10mM 或者10×工作濃度.探針應該避光保存，貯存在-70度,最好以凍干粉狀態，工作濃度的液體保存一般兩周左右。

2.輸入靶序列，用BLASTn在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast進行比對
3.檢查比對序列的多態性以及可能的錯誤避免這些區域來進行引物和探針設計
4.在靶序列中避免直接待重復區，在重復區進行雜交容易使得引物非獲得產物性結合，降低DNA的擴增效率以及減少分析的靈敏度。
5.考慮到潛在的剪接變異體以及合適的所需要的獲得到靶，通過學分析內含子以及外顯子的邊界，主要通過cDNA和基因組序列比對來確定。一般都設計跨最長內含子區，這樣減少了擴增子受到基因組DNA的污染的影響。這是十分有必要的，特別當用DNA做歸一化處理以及靶向某一特異的剪接變異體。最經濟的做法是讓下游引物跨越剪接接頭，這樣允許使用一條探針檢測可能剪接變異體.然后如果在有效性和靈敏度無法保證情況下，可以使用跨越單一外顯子的設計方案。我們還是建議試驗者用DnaseI處理樣品，除去gDNA的污染。
6.在RT步驟時，用(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi)工具檢測在特定溫度下靶序列的折疊情況，避免一些高度次級結構的區域，那些區域探針和引物結合效率較低
7.盡可能用60-150bp的擴增產物，GC含量在60％或者稍小來確定高效的變性，更高度反應效率。GC含量高度序列容易產生非特異性的反應，短序列擴增是
的擴增時間縮短gDNA污染可能性減少。短的序列容易人工合成，用來做擴增多標準曲線。用oligodT進行逆轉錄最好設計擴增子位于靠近模板的3’區域