“一體兩型三化”——多糖類手性柱的美好時代

“一體兩型三化”——多糖類手性柱的美好時代

引：手性色譜技術，作為最重要的手性分析方法之一，不僅可以快速地分析對映體純度（ee值或者de值測定），而且也可以用于光學異構體的大量制備拆分（Preparative enantioseparation）。開發手性識別能力強、適用范圍廣、高效的手性固定相（Chiral Stationary Phases，CSPs）是手性色譜技術的關鍵和核心，亦是共性技術。在諸多被開發出來的手性固定相中，多糖衍生物手性固定相因其適用范圍廣、載樣量大等優點而被視為最具發展潛力的一類手性固定相。以直鏈淀粉-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）手性固定相（多糖衍生物正相手性柱CHIRALPAK AD/CHIRALPAK AD-H/ CHIRALPAK AD-3/ CHIRALPAK IA）為例，本文總結了近年來多糖類及其衍生物手性固定相的開發應用新進展。

關鍵詞：polysaccharide-based chiral stationary phases；多糖衍生物手性固定相；CHIRALPAK AD；CHIRALPAK IA

多糖衍生物，特別是直鏈淀粉、纖維素的衍生物作為手性選擇子，在色譜分離（HPLC & SFC）領域得到了非常深入而細致的應用研究。到目前為止，已有許多多糖類手性固定相被商品化，就當前新近開發應用特征而言，六字訣——“一體兩型三化”。即：一體，手性選擇子為多糖體（多糖衍生物）；兩型，制備方法分物理涂敷型和化學鍵合型；三化，分析微型化，制備規模化（工業化），應用綠色化（chiral SFC & chiral SMB）。

“一體”：手性選擇子為多糖體（多糖衍生物）

多糖類手性材料研究，可以追溯到上個世紀50年代初期，M. Kotake等采用紙色譜法，將纖維素和直鏈淀粉添加到展開劑中來分離氨基酸。（紙色譜法拆分氨基酸，文章發在令人仰望的JACS上，<Resolution into Optical Isomers of Some Amino Acids by Paper Chromatography  M. Kotake, T. Sakan, N. Nakamura, S. Senoh. J. Am. Chem. Soc., 1951, 73 (6), pp 2973–2974 DOI: 10.1021/ja01150a548>，現在看來有點不可思議！從一個側面說明科技的突飛猛進。題外話）但由于天然纖維素和直鏈淀粉因溶解性不好，分離能力不高，應用受到限制。沉寂了大約20年后，G. Hesse and R. Hagel在1973年首先制備了微晶纖維素三乙酸酯（CTA）。當微晶纖維素三乙酸酯溶解于溶劑并涂敷在硅膠上時，第一個被研究的纖維素衍生物手性分離材料就這樣神奇地誕生了。后來，名古屋大學岡本佳男（Yoshio Okamoto）教授等人開發的多糖衍生物類手性固定相發展成為相當有用的分離工具。纖維素是葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接成的線性聚合物，而淀粉則是α-1,4-葡萄糖苷連接的螺旋結構。對多糖進行化學衍生不僅可以增加多糖手性識別位點，如酰胺、酯、不同官能團取代的苯基等，也能在多糖表面形成手性空穴，提高多糖的手性識別能力。將這些多糖衍生物涂敷在硅膠表面上就得到了涂敷型多糖手性填料。衍生化多糖的官能團、聚合物平均分子量及其分布、涂敷用的溶劑類型、硅膠孔徑等對多糖手性填料的拆分能力均有影響。比如，對于苯基氨基甲酸酯衍生多糖類手性固定相而言，苯環上取代基的性質、數目及位置對CSP的拆分能力均有影響。新型手性選擇子纖維素-三(氯代甲基苯基氨基甲酸酯)的苯基部分包含吸電子的氯和供電子的甲基，在某些情況下這種固定相的手性識別能力優于Chiralpak AD柱，可以互為補充。

一句話，多糖體手性填料是一類手性拆分能力強、柱容量大、應用范圍廣、使用最普遍的手性填料之一，已有許多商品化多糖手性柱出售（做廣告咯，Daicel、Kromasil、Macherey-Nagel、Phenomenex、Regis等都有售！）。

“兩型”：制備方法分物理涂敷型和化學鍵合型

多糖體手性選擇子，化身為多糖類手性柱，需要經歷一個加工成型的過程。當前，已經規模化的、技術成熟的多糖衍生物手性固定相制備方法主要有兩種：涂敷法和鍵合法。不同的鍵合或交聯方法是目前研究的熱點，比如（非）區域選擇性鍵合法、共聚-交聯法、整體成球法等。

涂敷法，即將多糖衍生物溶解于合適的有機溶劑(稱為涂敷溶劑，例如以二氯甲烷、氯仿等作為涂敷溶劑) ，再加入硅膠載體，充分吸附多糖衍生物，然后采用減壓蒸發溶劑法除去涂敷溶劑，使多糖衍生物析出并附著在硅膠表面而制備成適用于液相色譜的涂敷型手性固定相（coated CSPs）。這種方法主要是依靠多糖衍生物與硅膠擔體之間的氫鍵作用而將其固定在硅膠表面，這種相互作用力相對較弱，一些能溶解多糖衍生物的溶劑，如二氯甲烷、乙酸乙酯以及四氫呋喃等都不能用作流動相，因此只能用非極性烷烴和醇作為流動相。為了克服涂敷型多糖衍生物在某些溶劑當中會溶脹或溶解的缺點，人們想方設法尋求限制下的突破，將多糖衍生物鍵合到硅膠表面，開發了各種鍵合方法，以擴大流動相使用范圍。

鍵合法，多糖衍生物，通過化學反應鍵合于硅膠或其他載體表面，相互交聯成網狀聚合物而形成鍵合型手性固定相（Immobilized CSPs/Covalently bonded chiral stationary phase）。因此，鍵合的多糖衍生物手性固定相比同類型的涂敷型手性固定相，在流動相選擇方面范圍更廣泛，比如可以用四氫呋喃或二氯甲烷等作流動相。但在手性柱使用過程中，我們發現鍵合型CSPs與涂敷型CSPs在分離某些化合物時會有區別，這主要是因為鍵合型CSPs在制備過程中一定程度上破壞了多糖的空間排列，而這種結構可能有利于增強其手性識別能力。雖然鍵合型CSPs拆分能力沒有涂敷型高，但其柱效、穩定性、耐溶劑性能等都高于涂敷型，而因鍵合方式所致的手性識別能力降低由擴大流動相的選擇范圍來彌補。所以，鍵合型多糖手性固定相自2004年上市以來逐漸得到了廣泛的應用。

我們知道，涂敷型多糖類手性固定相在正己烷-無水乙醇和正己烷-異丙醇的正相流動相體系中穩定性好，可拆分各類手性化合物。但由于許多手性物質在正己烷-醇的流動相體系中溶解性差，限制了這類固定相在制備型拆分中的應用。鍵合法則可提高固定相的耐溶劑性能，雖然固定相的手性識別能力略有降低。“寸有所長，尺有所短”，涂敷型固定相有流動相選擇范圍小的缺點，而鍵合型固定相則有拆分能力稍降低的短板。基于此，多糖衍生物手性固定相的發展，“一大理想”：保持固定相的手性識別能力的同時，提高固定相的耐溶劑性能！若能在提高固定相的手性識別能力的同時，改善提高固定相的耐溶劑性能，那就更完美了。有理想，就得努力去實現！“兩大策略”：一方面，采用涂敷法，開發適用范圍更廣的新型多糖體手性選擇子，進一步提高固定相的手性識別能力，拓展其應用范圍；另一方面，采用鍵合法，發展新的鍵合方法，改善多糖衍生物耐溶劑性能的同時，保持甚至提高固定相的手性識別能力。這與我們大家熟悉的反相液相色譜有些許類似，比如在做RP-HPLC方法開發時，一方面可以優化流動相體系，另一方面也可以選用不同的C18柱（優化色譜柱）。說到這里，不能不提一下大賽璐（Daicel）公司，鍵合型手性柱Chiralpak IA、Chiralpak IB、Chiralpak IC和新型手性選擇子涂敷型手性柱Chiralpak AY-H、Chiralcel OZ-H的推出上市，這簡直就是“一大理想，兩大策略”的完美體現。Daicel 公司采用交聯-共聚法等鍵合專利技術制備多糖體手性填料，在提高固定相的耐溶劑性能、拓寬流動相的使用范圍的同時，保持了固定相的手性識別能力。目前，這類技術已被采用并有商品化手性柱上市。

“三化”：分析微型化，制備規模化（工業化），應用綠色化（chiral SFC & chiral SMB）

我們知道，液相色譜分離領域已跨入超高效液相色譜（UPLC）的嶄新時代，追求更高分離效率、更快分離速度是色譜技術發展的主旋律。根據色譜速率理論（范特姆特方程Van Deemter），粒徑越小，柱效越高。減小粒徑是提高分離效率和分離速度的一種有效手段，小顆粒填料技術催生了超高效液相色譜的誕生。同樣地，手性填料自然也不甘落后，以多糖類手性柱Chiralpak AD為例，從最初的20 μm （制備型分離用）→ 10 μm → 5 μm→ 3 μm，商品化的手性柱Chiralpak AD → Chiralpak AD-H → Chiralpak AD-3，填料顆粒逐步亞微米化，使得3微米填料正在成為業界的新寵。使用亞微米的填料，在提高色譜分離能力的同時減少了溶劑的用量。另一方面，醫藥工業中手性藥物的發展強烈需求規模化制備方法。化學合成（拆分）法、生物催化法、制備色譜法等都是最常用的獲得光學純物質的方法。化學合成法，具有廣泛的工業化前景，但存在立體選擇性不夠高，反應收率較低的問題，特別是不對稱合成反應，不能同時獲得兩種構型的光學異構體（以含1個手性中心的化合物為例），規模化生產尚有許多問題需要解決；而生物催化法雖然光學收率較高，但有機溶劑和水的消耗量大，后處理復雜，生產效率較低等。手性制備色譜法是獲取光學異構體最簡便快捷的方法，尤其在藥物發現階段大有用武之地！

當今，“低碳環保”已經滲透到我們生活的方方面面，那么手性藥物的規模化制備方法如何“綠色”呢？超臨界流體色譜法和模擬移動床技術在手性藥物大規模拆分中的應用，就體現出綠色環保的理念：超臨界流體色譜法SFC，道法自然，采用天然“綠色”的超臨界流體CO₂作為溶劑，無需有機溶劑回收處理，省事經濟環保，節能降耗又可持續使用，因而SFC對手性藥物制備拆分具有獨特的吸引力。模擬移動床技術（Simulated Moving Bed Chromatography，SMB），已成功地制備出大量手性化合物的光學純對映體。雖然由于技術保密的原因，僅有少部分在期刊文獻中報導，然而窺斑知豹，足以顯示出這項新技術對手性藥物發展的重要性。最近的發展更是出現這樣一種趨勢，在多糖類手性固定相上，采用單一溶劑流動相體系（大多數情況下為醇類，極性有機相分離模式），可以得到很高的產率，且溶劑可循環利用。

題外話

說到手性技術，不管是不對稱催化還是手性色譜技術，我們的鄰居泥轟國都值得我們琢磨琢磨：不對稱催化（野依良治Ryoji Noyori，2001年諾貝爾化學獎獲得者）；手性分離材料開發（岡本佳男Yoshio Okamoto，2006年諾貝爾化學獎提名）。慶幸的是，國內的中科院系統、高等院校有不少從事這方面研究的，出了不少文章，但轉化成現實還有距離，需要持續的努力，路漫漫，人盼盼。。