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Cell精選 |腸心軸研究：非靶+靶向+微生物組研究菌群代謝物苯乙酰谷氨酰胺是增加心血管疾病又一推手

鹿明生物

2022.9.15

前言

心血管疾病 (CVD) 仍然是西方國家死亡和發病的主要原因，因此需要有助于 CVD 發展和進展的新治療靶點。非靶向代謝組學正在成為發現與疾病相關的途徑的強大平臺，作者對 T2DM 受試者的血漿進行了非靶向代謝組學分析，并結合機理研究，揭示了通過代謝途徑形成的代謝物在 T2DM 受試者中增強，并與 T2DM 和非糖尿病受試者的 CVD 風險升高相關。

必需氨基酸苯丙氨酸(Phe) 是腸道微生物群產生的代謝物苯乙酰谷氨酰胺 (PAGln)的營養前體，PAGln 在臨床和機制上都與 CVD 相關，并顯示通過宿主 G 蛋白偶聯受體促進 CVD 相關表型，包括 α2A、α2B 和 β2-腎上腺素能受體 (ADR)。

本篇由美國克利夫蘭診所勒納研究所心血管與代謝科學部Stanley L. Hazen教授課題組在Cell期刊（IF:66.850）發表了題為 “A Cardiovascular Disease-Linked Gut Microbial Metabolite Acts via Adrenergic Receptors ”的研究成果，通過非靶向代謝組學、靶向代謝組學與腸道微生物菌群聯合研究方法，發現了心血管疾病發生的特征，為心血管疾病防治提供了理論依據。

技術流程

研究方法

研究材料/樣本：

無菌小鼠，兩個臨床隊列（5162名受試者）

主要組學研究方法：

? ?LC-MS 非靶標代謝組分析、靶向代謝組學、腸道微生物研究

研究結果

1. 非靶向代謝組學：鑒定 PAGln 與 CVD 相關

對1162名受試者血漿進行非靶向代謝組學檢測，三個篩選策略如下：(1)與事件（3年）主要不良心臟事件（MACE =心肌梗死（MI）、中風或死亡）相關；(2)T2DM水平升高；(3)與血糖控制指標的相關性差。研究發現一種與MACE最相關未知物（m/z 265.1188）滿足篩選標準（圖1A, B），經鑒定該物質為PAGln（圖1C）。建立該物質同位素液相色譜串聯質譜(LC/MS/MS)絕對定量方法，對另一獨立隊列（n=4,000，驗證集）進行PAGln靶向驗證，該隊列中T2DM受試者和MACE受試者血漿PAGln水平都相對較高。Kaplan-Meier生存分析顯示，高PAGln水平與MACE高風險顯著相關（圖1D），較高的PAGln水平仍是MACE風險的獨立預測因子（圖1E）。

圖1 | 非靶向代謝組學研究發現m/z為 265.1188 的代謝物與心血管疾病風險相關，隨后被鑒定為苯乙酰谷氨酰胺

2. 功能驗證：腸道微生物群參與體內PAGln 和苯乙酰甘氨酸的產生

通過檢測基線（Pre-Abx）、7天廣譜復合抗生素處理（Abx）和3周清除期菌群重塑（Post-Abx）的血漿PAGln水平（n=15），發現PAGln水平受腸道微生物影響（圖2A）。有研究表明，PAGln由苯乙酸（PAA）與谷氨酰胺（Gln）在肝酶的作用下形成，而PAA由苯丙氨酸（Phe）經菌群代謝產生。此外，PAA也可與甘氨酸（Gly）結合形成苯乙酰甘氨酸（PAGly）。

研究人員評估了健康受試者（n=25）和小鼠體內PAGly及PAGln水平，結果發現，人體中以PAGln為主，而小鼠中以PAGly為主（圖2B），小鼠腹腔注射PAA后，主要生成PAGly（圖2C）。比較常規飼養和GF小鼠或Abx干預前后的血清PAGly水平，表明腸道菌群是生成PAGly的重要參與者（圖2B, 2D）。因此，在人類和小鼠中，PAGln和PAGly都是通過一種代謝途徑產生，飲食中的Phe通過腸道菌群轉化為PAA，宿主與Gln（人類）或Gly（嚙齒動物）發生共軛反應，分別產生PAGln和PAGly（圖2E）。

圖2 | PAGln體內生產是人類和小鼠中微生物群依賴性的過程

3. 表型驗證1：PAGln 增強血小板刺激誘導的鈣釋放和對多種激動劑的反應

根據人PAGln水平與血栓事件正相關性，提示PAGln可影響血小板功能和血管基質相互作用。研究結果顯示，PAGln加速了膠原依賴性血小板粘附和擴散速度（圖3A-3C），并呈現劑量依賴性（圖3D, 3E），表明PAGln可能與血小板直接相互作用，促進胞質內Ca2+濃度（[Ca2+]i）呈現依賴性升高，并進行了相關驗證（圖3G）。此外，在PAGly實驗中也觀察到類似結果。因此，腸道菌群相關代謝產物PAGln和PAGly顯著影響血小板功能，增強血小板與膠原基質的粘附，以及血小板刺激依賴性[Ca2+]i升高和對激動劑的聚集反應。

圖3 | PAGln 增強血小板反應性

4. 表型驗證2 :PAGln 加速血小板凝塊形成并增強體內血栓形成潛力

通過FeCl3誘導的頸動脈損傷模型研究發現，PAGln和PAGly都能加劇損傷的頸動脈內血栓形成（圖4A），且與對照組相比，相應地減少了損傷后血流停止的時間（圖4B）。

圖4 | PAGln 和 PAGly 增強體內血栓形成的可能性

5. 機制探究1：腸道微生物基因porA和fldH在體內調節宿主血栓形成潛力

有研究報道Phe主要由生孢梭菌（Clostridium sporogenes）代謝為PAA（氧化途徑）和苯丙酸（PPA）（還原途徑），隨后分別與Gln或Gly縮合形成PAGln或PAGly。其中參與反應的酶主要由porA或fldH基因編碼。于是作者構建了porA或fldH基因缺失的C. sporogenes突變株。結果顯示，含有功能性基因porA和fldH的(ΔcutC) C. sporogenes僅產生同位素標記的PPA，而不產生PAA；（ΔcutC,ΔfldH）C. sporogenes(具有porA功能)不再產生PPA；（ΔcutC,ΔporA）C. sporogenes（具有fldH功能）不再產生PAA（圖4C）。然后通過突變株定植GF小鼠以及頸動脈損傷實驗表明，基因porA主要影響PAA產生，而fldH主要調節PPA產生，且敲除fldH會增加PAA水平繼而影響PAGly水平從而顯著降低血栓形成。

6. 機制探究2：PAGln 通過 G 蛋白偶聯受體介導細胞事件

研究發現，GPCR信號通路調節劑和抑制劑均顯著降低了PAGln誘導的DMR反應（圖5A，5B）。進一步研究發現PAGln可影響cAMP水平，并證實PAGln在多個細胞中包括分離出的人血小板中通過GPCR(s)介導細胞反應。研究人員發現PAGln與兒茶酚胺結構相似（圖5E），暗示PAGln通過腎上腺素能受體（ADRs）發揮作用。遺傳和藥理學方法的功能喪失和功能獲得研究證實，PAGln可通過G蛋白偶聯受體（包括α2A，α2B和β2-ADRs）介導細胞反應（圖5和圖6A, B）。

圖5 | PAGln 通過 G 蛋白偶聯受體和 ADR 介導細胞反應

7. 功能驗證：腸道微生物群依賴性代謝物 PAGln 通過 ADR 發揮作用

通過功能增益研究證實 PAGln 可以通過 α2A、α2B 和 β2 ADR 發出信號，為了進一步證實 PAGln 通過 ADR 發揮作用的能力，研究者在人胚胎腎細胞(HEK293) 中單獨過表達 α2A、α2B 和 β2 ADR 進行了功能獲得性研究。在多種細胞類型中采用遺傳或藥理學方法的功能喪失和功能獲得研究均證實 PAGln 可通過 α2A、α2B 和 β2 ADR 誘導細胞反應。

圖6 | PAGln 通過 ADR 調節血小板功能和體內血栓形成潛力

研究討論

目前的研究證實了腸道微生物群在人和小鼠的 PAGln（和 PAGly）生成中的主要作用，PAGln 升高與 CVD 風險之間的臨床關聯可能通過幾種機制發生。首先，PAGln 可能通過多種互補方法影響血栓形成，其次，PAGln 可能與GPCRs （包括 ADRs）的相互作用影響 CVD 的相關表型。盡管目前的研究僅關注人類血小板中表達的三種 ADR，但可以推測 PAGln 具有調節其他 ADR 的潛力，因此可能會影響多種與 ADR 相關的體內生理過程。

研究證實，腸道微生物群衍生代謝物 PAGln 可增強全血、分離的血小板和動脈損傷動物模型中的血小板活化相關表型和血栓形成潛力。對人類共生體的功能和基因工程研究，再加上無菌小鼠的微生物定植，表明微生物基因有助于將膳食苯丙氨酸轉化為 m/zporA苯乙酸，隨后宿主產生 PAGln 和苯乙酰甘氨酸 (PAGly)，促進血小板反應性和血栓形成潛力。使用遺傳和藥理學工具的功能增益和功能喪失研究均揭示 PAGln 通過 G 蛋白偶聯受體介導細胞事件，包括 α2A、α2B 和 β2-腎上腺素能受體。因此，PAGln 代表了一種新的促進 CVD 的腸道微生物群依賴性代謝物，它通過腎上腺素能受體發出信號。

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這項研究通過兩個臨床隊列的非靶向代謝組學和靶向代謝組學以及微生物菌群的研究發現了一種新的心血管疾病相關的腸道菌群代謝衍生物——苯乙酰谷氨酰胺（PAGln），體內外實驗揭示了該物質的菌群和宿主代謝途徑，以及促進血栓形成的分子機制，證實了腸道菌群-代謝物在心血管等臨床疾病中發揮著不容忽視的重要作用。為心血管疾病研究奠定了堅實的基礎。

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