體外診斷產品相關原材料（五）
五、反應環境
1．阻斷劑
阻斷劑（blocker），是一類能應用于在體外診斷試劑開發過程中，以達到減少來自患者樣本中的蛋白質干擾或者試驗過程中的其他因素影響并由此可能造成的假陽性，假陰性的錯誤檢測結果的物料的統稱。
眾所周知，對于所有的用于體外診斷試劑開發的方法有幾個參數是決定檢測方法性能的關鍵：（1）固相材料的選擇（2）抗體/抗原的選擇（3）阻斷劑的選擇。為了生產出高靈敏度和高特異性的試劑，最關鍵的因素是選擇具有與靶分子的高特異性結合的抗體或抗原。實際試驗過程中，正確地使用阻斷劑也有助于提高檢測的靈敏度和特異性。這些阻斷劑的使用可以有效地減少非特異性結合以增加信噪比，提高診斷試劑的臨床使用性能。
在免疫學檢測試驗中非特異性結合可發生于（1）固相材料和非目標的蛋白質結合 （2）患者的樣品中存在的內源性抗體和檢測試劑內抗體的結合。為了防止非特異性結合，要求在體外診斷試劑研發生產過程中要在固相材料包被之后使用阻斷緩沖劑中以封閉固相材料上任何剩余未結合的位點，同時在準備檢測樣本的過程中使用其他的阻斷劑以防止內源性干擾抗體與檢測試劑組分抗體結合。
（1）用于固相材料阻斷的封閉劑緩沖液
固相的定量免疫學測定方法，如酶聯免疫吸附，橫向免疫層析，以及免疫印跡均涉及抗體通過共價結合包被到固相材料的表面上這一過程。固相材料表面其他蛋白質或生物分子的非特異性結合可以減少檢測的特異性和靈敏度。由此而專門設計的固相材料封閉劑是用以飽和固相材料的表面上未被抗體包被的結合位點以防止其他物質的非特異性結合從而提高試劑的靈敏度。
? ? 開發一種新的免疫檢測試劑，通常第一步就是優化抗原或捕獲抗體在固相材料上的包被條件以期最大限度地把有效蛋白包被到固相材料表面。包被之后，固相材料表面任何剩余的未占據的結合位點必須被封閉以防止非特異性物質的結合。一個理想的封閉劑通常為蛋白質，因為它能夠有效地封閉固相材料表面疏水性和親水性位點。此外，它可以作為一種穩定劑用以防止蛋白在與固相材料的表面反應時發生變性。封閉劑的用量和使用時間必須根據不同的檢測方法進行優化。封閉劑的用量不足會導至背景信號過高，減小信噪比，而使用濃度過高的封閉劑則可能掩蓋抗體-抗原相互作用，也可引起信噪比的減小。
從以下圖中可以很清晰的看到使用固相封閉緩沖液的效果：
理想的固相封閉劑應該具有以下特征：
?? 有效地阻斷測定反應物非特異性結合到固體材料表面
?? 不影響已包被到固體材料表面的試劑有效成分
?? 可以起到試劑有效成分在固相表面穩定劑（防止變性）的作用
?? 不與其它試劑有效成分發生交叉反應
?? 不具有酶活性并由此可能與試劑中的底物反應而使信號加強或降解試劑中的反應物
?? 批間差異小
（2）能夠阻斷試驗過程中出現的干擾的被動阻斷劑和主動阻斷劑
免疫檢測干擾是一類會引起檢測結果假陽性或假陰性現象的泛指，潛在的干擾因素包括內源性抗體或病人樣本中的其它結合蛋白，多反應抗體，自身抗體（嗜異性抗體）和人抗動物抗體。
在免疫檢測時，干擾物可通過非特異性結合來干擾抗體和分析物之間的反應，一方面抑制目標分析物與檢測抗體的結合，產生假陰性，另一方面又可以在缺少目標分析物的情況下與捕獲和檢測抗體結合，從而產生假陽性。
容易受到干擾的檢測包括雙抗體夾心抗原檢測，競爭性檢測和IgM捕獲檢測。文獻中報道過的典型的例子包括對ToRCH，CEA，CA-125，CK-MB，LH，FSH，prolactin，TSH，AFP，cardiac troponin I (cTnI)和HCG等的檢測。常見的能引起雙抗體夾心檢測抗原和競爭法檢測偏差的主要是異嗜性抗體（HA）的干擾，HA是一類結合力弱的天然抗體，可與來自不同物種的免疫球蛋白反應，這些物種包括小鼠，山羊，兔子，綿羊和雞。在診斷檢測中，HA可以結合多種類型的無關抗原，從而干擾抗原—抗體的特異性結合反應。人抗小鼠抗體（HAMA）的干擾是HA干擾的一種類型，它可以特異性的結合小鼠抗體。因為小鼠單克隆在免疫檢測的商業診斷中應用非常廣泛，所以HAMA的干擾經常會遇到。例如人自身抗體類風濕因子（RF），可以與人自身的免疫球蛋白（IG）結合，同時也可以與動物免疫球蛋白交叉反應，可引起與HA/HAMA干擾類似的RF干擾。通常同種型（Fc 區域）特異性的HA干擾比異種型（Fab或結合位點）特異性的HA更普遍。
為了阻斷以上干擾因素在試驗過程中的影響，實際體外診斷試劑研發生產使用的阻斷劑通常分為被動阻斷劑和主動阻斷劑兩種，一般較為常用的其他動物IgG，屬于被動阻斷劑，其工作原理是通過干擾抗體和捕獲物的結合，提供可選結合位點來檢測抗體。動物IgG（例如羊IgG）只能封閉一種類型的干擾物（例如人抗山羊抗體），因此通常選用不止一種類型的IgG，這取決于捕獲和檢測抗體的性質。在實際試驗過程中，應該過量添加動物IgG，有效性取決于動物IgG對干擾抗體的親和力。
在雙鼠抗夾心法試驗中，需要使用特異性阻斷劑來除去特定類型的異嗜性抗體HA干擾，異嗜性抗體HA干擾主要包括人抗鼠抗體（HAMA）和類風濕因子（RF）的干擾，這個過程中所使用的特異性阻斷劑就是我們通常稱之的主動阻斷劑，這類主動阻斷劑包含一種針對所有類型異嗜性干擾包括HAMA和RF的特異性粘合劑，一旦與干擾抗體結合，通過與干擾物結合而產生空間位阻進一步阻止干擾物與分析物質結合。在實際使用過程中，主動阻斷劑的使用濃度通常低于被動阻斷劑，從而可以減少由于過量使用被動型阻斷劑而引起的檢測信號減小等負作用。
（3）專門用于IgM檢測試驗的阻斷劑
IgM抗體是機體免疫系統對于感染應答所產生的第一種類型的抗體，IgM的檢測是幫助識別早期和近期感染有價值的診斷指標。然而，IgM抗體僅占體內總抗體的5%至10%。與此相反，IgG抗體是體內含量最豐富的免疫球蛋白，它占了體內總抗體的約75%至80%。為了確保IgM的檢測的敏感性和特異性，阻斷含量豐富的IgG抗體和其它非特異性蛋白質，如類風濕因子等對于IgM的檢測的干擾是十分必要的。現在通常使用的IgG吸附劑是純化的山羊抗-人IgG（GAH IgG）的Fc片段，在IgM抗體檢測之前去除人血標本中的IgG以及IgG/類風濕因子（RF）結合物，可以顯著提高的IgM檢測方法的靈敏度。
在體外診斷試劑行業中，通常用的固相封閉劑大多是使用非靶標蛋白按照一定比例配合而成的緩沖液，具體的包括牛血清，馬血清，羊血清等動物血清，酪蛋白等非血清蛋白，牛血清白蛋白等通用無關蛋白。出于成本考慮，大多成熟的，有一定研發生產規模的體外診斷試劑生產廠家，在研發生產過程中大多會使用自有體系配制的固相封閉緩沖液；通常使用的被動阻斷劑大多為其他動物IgG，如羊IgG，兔IgG等；而通常具有知識產權保護的主動阻斷劑中一般含有鼠IgG抗體及其他清潔抗體。
在我國體外診斷試劑行業的發展初期，各體外診斷試劑生產廠家并沒有充分認識到阻斷劑的重要性，大多數體外診斷試劑公司一般根據生產需求簡單配制，在重復性，穩定性，使用效果方面參差不齊，導至國內研發生產的體外診斷試劑在臨床應用性能上與國外進口品牌有一定差距，假陽性，假陰性的結果難以消除。但是隨著我國體外診斷試劑行業的快速發展，行業細分越來越明顯，市場沖擊越來越大，國內體外診斷試劑生產公司越來越清楚地認識到產品質量才是能持續發展的最重要因素，因此他們不僅僅越來越重視研發生產所使用的抗原抗體，也越來越看重影響試劑品質的各個環節，更多的生產廠家開始接受商業化的封閉劑，阻斷劑。目前在市場上認可度比較高的主動阻斷劑的商業品牌有Roche的MARK33系列，Scantibodies的HBR系列，Meridian的TRUBLOCK系列，Millipore的CHEMIBLOCK系列，菲鵬的HIER系列等等。
2.蛋白保護劑
蛋白質（protein）是生命的物質基礎。它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯系在一起的物質，機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與。蛋白質分子由親水和疏水氨基酸組成，這樣的一種組成使得蛋白質在水溶液中會自然折疊，讓更多的疏水氨基酸折疊聚集在球形蛋白質內部，而讓更多的極性氨基酸暴露在能與水結合的表面。其他起到交聯效果的相互作用力包括靜電作用、氫鍵、范德華力、螯合作用以及共價鍵（比如：二硫鍵）。其中一些相互作用力對于諸如冷凍、干燥等相變產生的影響非常敏感。
在體外診斷試劑所用的原料中，抗體、抗原、酶等蛋白質是最為重要的關鍵原料。其所具有的特異性結合、催化反應功能，對在預處理、貯存、使用加工等操作過程中存在的潛在有害影響非常敏感。保存在密封、干燥的環境將有助于確保長時間的穩定，但除非蛋白得到適當的保護，否則干燥過程有也可能使蛋白發生嚴重的變性。而保存在溶液狀態，潛在的危害因素將會增多。比如很簡單的一個方面，pH值或者緩沖溶液的改變就能夠使蛋白在溶液中的穩定性明顯不同。使某種溶液狀態穩定的方法并不一定就對另一種溶液有效。在生產過程中的其他因素也有可能影響產品的性能。這些因素包括原料來源、稀釋和定時錯誤、溫濕度不合適、曝光和容器材料等。為了保證診斷檢測的有效期和精確性，這些原料蛋白必須保持穩定和有效。因此，在診斷試劑中必須要添加適當的，適量的蛋白保護劑。
（1）影響穩定性的原因
1.1 干燥狀態穩定性
盡管大多數蛋白質在溶液狀態的自然構象下發揮作用，但干燥或者冷凍狀態仍然是穩定保存的首選。在這些相對穩定的狀態下，諸如蛋白酶、氧化劑等有負作用的溶劑與蛋白質的頻繁碰撞將會得到最大限度的減少。但是通過干燥或者其他相變方式，比如沉淀和冷凍，將溶劑從蛋白分子中去除，將可能損害蛋白質的功能構造。這些相變可能使通常折疊在分子內部的疏水氨基酸暴露在分子表面，從而造成蛋白質分子通過疏水表面與其他分子結合，導至蛋白質分子的變性。干燥的方式包括自然風干或者冷凍干燥，例如試劑瓶中結合物的干燥、塑料板或者膜材料上包被抗體的干燥。
在要干燥的溶液中加入適當的溶質來防止蛋白質變性是一種非常有效的保持蛋白質穩定的方法。這些溶質的特點是都具有親水基團，這些基團通過掩蓋疏水性氨基酸從而達到穩定蛋白質功能構造的作用。因此，由于在干燥時溶劑的去除會促進蛋白與蛋白，尤其是蛋白與固相表面的相互作用，所以在干燥前加入保護劑非常重要。
無論是干燥方法還是保存條件，想要保持穩定都有很苛刻的要求。當蛋白應用到膜上時，通常要求非常快速的干燥或者凍干，以保持蛋白最佳性能和活力。而對于平板、試管或者微珠的蛋白包被來說，相對于快速干燥，確保組分的徹底干燥則更為重要。為了得到最大限度的有效期，所有干燥后的產品都需要保存在放有干燥劑的密閉容器中。
1.2 溶液狀態穩定性
雖然抗體、抗原、酶以及其他診斷用蛋白在水溶液中處于天然的機能狀態，但這并不是它們最穩定的狀態。在溶液中，有眾多的因素影響著蛋白的活性功能： ?
l 蛋白質分子變得更加柔韌易折，從而傾向于改變構象。
l 蛋白質分子和其他分子以及容器壁的碰撞頻率增加了。
l 微生物污染的可能性增加了。
l 對溫度升高和蛋白濃度降低造成的影響更加敏感。
l 蛋白質更易被氧化。
通常來說，溶解的蛋白質分子在較低的溫度和較高的蛋白濃度下最為穩定。在剛好高于冰點的時候，蛋白質分子擁有較少的動能，而這些動能是蛋白質“擺脫”其能量最低的功能構造所必需的。在溶液中，部分蛋白活性的損失是由容器壁的吸附、寡聚酶的解聚以及氧化劑、水解酶、微生物等痕量污染物對蛋白質的滅活等原因造成的，而在越高的蛋白濃度下（毫克每毫升范圍或更高），損失的蛋白活性占蛋白總活性的比例也就越低。
1.3 影響穩定性的其他因素 ?
蛋白來源、純化方式以及化學偶聯的方法都能影響蛋白試劑的活性和穩定性。例如，堿性磷酸酶的來源就對復合物的穩定性有重大影響；就溶液的穩定保存而言，將所需蛋白與對蛋白有傷害作用的酶（如水解酶、氧化酶）從原料中分離是非常重要的。若要保證溶液穩定，就必須去除或者滅活這些有害酶以及能產生這些酶的微生物。在合成復合物時，大量的化學反應步驟已被證明能使酶和抗體分子之間形成共價鍵。其中的一些方法對某些酶-抗體復合物的穩定負面影響較低。如果一種酶聯復合物喪失了酶聯檢測的活性但仍保持有酶活力，那么另外選擇一種化學偶聯方法也許能解決這個穩定性問題。
有時候，被認為是穩定性方面的問題實際上是由其他變數造成的蛋白量不足。也許就是一個很明顯的稀釋錯誤。生產商必須棄用那些有可能吸收蛋白或者抑制蛋白活性的容器材料，例如未處理的聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯或者玻璃。聚乙烯和聚丙烯是比較可取的容器材料。有色酶和其他含有氧化金屬離子的蛋白溶液不能暴露在陽光下。
（2）蛋白保護劑種類
影響蛋白活性的因素主要有溶液的PH值、鹽分和糖分的濃度、微生物的作用及空氣的氧化等。針對市場的需要，目前市面上有很多商品化的蛋白保護劑可供臨床和科研生產廠家大批量使用，主要用于微孔板的封閉穩定、抗體稀釋液、蛋白稀釋液、酶穩定液等。選擇這些商品化的試劑在研發初期會給部分企業解決很多問題并且節省研發時間。有些企業，出入成本的考慮，也會著手研發自己的蛋白保護液配方以降低成本以及獲得更好的效果。目前蛋白保護劑主要包括：多羥基化合物、糖、氨基酸、聚合物、蛋白質等。
2.1多羥基化合物
多羥基化合物用作蛋白的保護劑由來已久，常見的該類保護劑有甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇、硫醇、聚乙二醇等。甘油可促進凍干處理的過氧化氫酶復性，且隨著甘油濃度上升至0.8%時，過氧化氫酶能夠完全復性。甘露醇不僅可作為優良的骨架劑使用，而且在一些處方中它能夠兼作蛋白質的凍干保護劑。甘露醇對蛋白質的保護作用與其濃度、形態結構有關，而其濃度與結晶形態有時呈一定的關聯性；通常認為無定型甘露醇具有使蛋白質穩定的作用，而結晶態的甘露醇則失去保護功能；1%或更低濃度的甘露醇通過無定型結構的形成而阻止蛋白質的聚集，但是高濃度的甘露醇則易于形成結晶態而促進蛋白質的聚集。
2.2 糖
糖是最常見、使用最廣的一類保護劑，是蛋白質的非特異性穩定劑。糖的保護作用與其及蛋白質的種類有關，而雙糖是研究最多也是公認最有效的保護劑，其中蔗糖是由一分子葡萄糖及一分子果糖所構成的雙糖，化學性質穩定，多呈無定型結構，對阻止蛋白質二級結構改變及貯藏期內蛋白質的伸展和聚集起顯著作用。
糖對蛋白質的保護作用大小有時依賴于其濃度，通常在某個濃度范圍內，糖的保護作用隨著濃度的升高而增大；當達到某一濃度時，保護作用達到最大值，而此后再增大糖的濃度則保護效果不再顯著增加，有時反而會降低。糖獲得最大穩定作用的最低濃度是其足夠在蛋白質表面形成一個單分子層的濃度。實際上，糖對蛋白質的保護作用不僅取決于糖的總體濃度，而且還與兩者的比例有關。
糖的還原性及其它性質（如旋光性）也會影響其對蛋白質的保護作用。葡萄糖、 乳糖、麥芽糖、纖維二糖等還原性糖均有可能與蛋白質上暴露的某些氨基酸殘基 發生邁拉德反應（即羰氨反應或棕色反應〕，使制品變黃和蛋白質活性降低；而旋光性不同的麥芽糖糊精對乳酸脫氫酶的保護作用顯示出很大差異。
2.3 氨基酸
氨基酸是常見的蛋白質保護劑之一。低濃度的甘氨酸可通過抑制10或100mmol/L磷酸緩沖鹽結晶所致pH值的改變而阻止蛋白質變性。無定型甘氨酸可阻止凍干過程中重組人生長激素的聚集；結晶型甘氨酸能升高成品的塌陷溫度，阻止因塌陷而引起的蛋白質藥物的破壞。常用的氨基酸類蛋白質保護劑有脯氨酸、L-色氨酸、谷氨酸鈉、丙氨酸、甘氨酸、賴氨酸鹽酸鹽、肌氨酸、L-酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等。
2.4 聚合物
聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、明膠、聚乙烯亞胺等聚合物也常用作為蛋白質的保護劑。通常聚合物的穩定作用取決于聚合物的多重性質，如優先從蛋白質表面析出、表面活性、使蛋白質溶液黏度升高從而阻止其他小分子（如糖及多羥基化合物）的結晶、pH值的劇烈變化等。不同聚合度及濃度的聚合物所提供的保護作用不同，如聚合度大的PVP有著較高的玻璃化溫度，隨著濃度及分子量增加，水溶液的黏度隨之變大，蔗糖的玻璃化溫度明顯升高，對冷凍過程中的蛋白質所起的保護作用隨之也有所增加；但聚合度過大時，聚合物會在冷凍過程中結晶，從而失去對蛋白質的保護作用，而且濃度及分子量過大時會增加最終產品的水分，使得蛋白質變得更不穩定。
2.5 蛋白質
蛋白質類保護劑可分為兩種：一種是蛋白質制品自身，另一種為外來蛋白質。蛋白質的活性和蛋白質的起始濃度有直接關系。蛋白在高濃度時更不容易降解（>1mg/ml），在低濃度時(<0.1mg/ml)極易降解而失活。當濃度較低時，通常都會加入外來蛋白質作保護劑，如牛血清白蛋白（BSA）是一個經典、優良的蛋白質穩定劑。另一方面，加入的蛋白也可以減少目的蛋白由于管壁吸附所造成的損失。通常蛋白的儲存容器應由不吸附蛋白質的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硅烷化容器。
2.6 防腐劑
隨著保存時間的延長，蛋白及穩定劑中的氨基酸、糖類等有機物易受到空氣、水中微生物的污染。為了防止微生物污染，終濃度0.02% (w/v)的疊氮化鈉或終濃度為0.01％(w/v)的硫柳汞可以抑制微生物的生長。 疊氮化鈉會干擾任何含有氨基基團的偶聯，因此在進行偶聯之前，應將疊氮化鈉去除。偶聯后的蛋白可以加入疊氮化鈉保存。
3 發展與機遇
近年來隨著國內診斷試劑廠家技術上的飛速發展，成熟的診斷試劑平臺，如：固相定性反應的ELISA平臺正逐步向液相定量檢測試劑平臺更新換代（全自動磁微粒化學發光平臺），達到了與世界先進診斷公司相同的技術水平。更高的技術平臺對診斷試劑就有更高的要求，這種完全液相的反應體系對于診斷試劑的穩定性、重復性、批間差等指標有了更高的要求。蛋白保護試劑看上去都是一些常規的蛋白以及化合物，但會影響到檢測結果的有效性和精確性，還需要各廠家給予更大的重視。蛋白質的穩定機制相當復雜，對緩沖液中各組分配比的研究有待進一步的優化。開發更優越的保護劑配方，提高診斷試劑的質量仍將是現今國內診斷試劑廠家加大研發投入的熱點之一。
4總結與展望
中國體外診斷試劑原料市場的2016年，是舉世翹望、紛至沓來的一年，Medix、Meridian、BBI先后在中國設立全資子公司，更多原料供應商正摩拳擦掌躍躍欲試，希望盡快以全資姿態進入中國市場，在中國、以中國的方式、為中國客戶服務。
原料，是診斷試劑的核心。在絕大多數項目的優質原料乃至頂尖原料唾手可得、原料來源與國際大廠比肩的今天，中國的體外診斷工業可以將更多精力和智慧集中在儀器設備的改進和試劑工藝的優化上，精雕細琢，終能打造蜚聲國際的精品。
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焦點事件
