干細胞成骨誘導后的染色方法和步驟
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堿性磷酸酶（ALP）是成熟成骨細胞的標志性酶，同時成骨細胞形成的鈣結節也是成骨細胞的標記物。???
以ALP為目標物的檢測方法：??
1?Gomori鈣鈷法??
【染色原理】???
ALP在pH值9.4的環境下，以鎂離子作為激活劑，能夠把β-甘油磷酸鈉水解出磷酸，磷酸與高濃度的鈣鹽結合形成無色的磷酸鈣，再與硝酸鈷作用形成磷酸鈷，經硫化胺處理形成黑色的硫化鈷沉淀在酶活性處。??
【孵育液配制】??
3%β-甘油磷酸鈉5ml??
2%巴比妥鈉5ml??
蒸餾水10ml??
2%?CaCl2?10ml??
2%?MgSO4?1ml??
【步驟】??
（1）將無菌的玻片放入培養皿中，傳代時加入適量的細胞懸液，作細胞爬片，呆細胞長滿玻片后取出。??
（2）PBS沖洗后用冷丙醇固定10min，蒸餾水沖洗數次。??
（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自來水沖洗數次。??
（4）2%硝酸鈷中浸3-5min，蒸餾水洗數次。??
（5）1%的硫化銨中2min，自來水沖洗，自然干燥，封固。??
【結果】胞質中陽性反應呈現灰黑色顆粒或塊狀沉淀。??
2?偶氮偶聯法：??
【孵育液配制】???
萘酚AS-BI磷酸鹽?20mg??
DMSO?0.5ml??
0.2mol/L巴比妥醋酸緩沖液（PH?9.2）?50ml??
六偶氮副品紅0.5ml??
1mol/L?NaOH調PH?9-10，混合后過濾使用。??
（六偶氮副品紅：副品紅400mg，濃鹽酸2ml，雙蒸水8ml混合過濾；臨用前與等體積4%亞硝酸鈉混合）??
【步驟】??
（1）細胞爬片成功后，PBS沖洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。??
（2）蒸餾水沖洗。??
（3）將過濾孵液直接滴加于玻片上，室溫下作用45min。??
（4）流水沖洗，晾干。??
（5）甘油明膠封固。??
【結果】成骨細胞胞質中可見紅色ALP陽性顆粒。??
3?堿性磷酸酶染色試劑盒法：??
【作用原理】?細胞內堿性磷酸酶在Ph9.4-9.6條件下水解磷酸萘酚AS-MX產生萘酚，后者被重氮鹽捕獲，生成不溶性有色沉淀。??
【作用液配制】??
取2號儲備液10ml，加3號液200ul，再加4號粉劑10mg，振搖速溶，立即過濾到細胞爬片上。?
【步驟】??
（1）細胞爬片滴加數滴1號液，室溫固定一分鐘（不可以延長），流水漂洗2分，晾干。??
（2）滴加作用液數滴，置濕盒內于37℃孵育2小時，流水沖洗2分鐘。??
（3）滴加5號液數滴，復染5分鐘，流水沖洗2分鐘，晾干。??
【結果】陽性結果是胞漿內出現藍色沉淀。??
針對鈣沉積物“鈣結節”的染色方法：??
4?茜素紅法??
【作用原理】利用沉積的鈣于茜素紅發生顯色反應，得到紅色的染色效果。??
【步驟】??
（1）培養皿用PBS沖洗2次，95%乙醇固定10min，雙蒸水沖洗3次。??
（2）0.1%茜素紅-Tris-Hcl（PH?8.3）37℃，30min。??
（3）蒸餾水沖洗，干燥，封片。??
【結果】染料品種的不同，礦化結節呈現不同的紅色。??
5?von?Kossa法??
【作用原理】??
Von?Kossa’s礦化結節染色法原理是將礦化基質中的磷酸鹽(鈣)、碳酸鹽(鈣)轉變為磷酸銀、碳酸銀，然后用日光、紫外線或強還原劑使其還原為黑色的金屬銀。本試驗染色過程中未作細胞襯染。??
【步驟】??
（1）培養皿用PBS沖洗2次，4％多聚甲醛固定5分鐘，雙蒸水沖洗3次。??
（2）培養皿中加入5％硝酸銀溶液1ml，將培養板開蓋在紫外燈下照射1小時。??
（3）倒出殘留的硝酸銀溶液，蒸餾水沖洗3遍。??
（4）培養皿中加入5％硫代硫酸鈉溶液1ml，中和殘留的硝酸銀溶液，吸出殘液。??
（5）室溫下晾干，封固。??
