質譜沙龍第二十四期活動報道
2009年12月5日下午，質譜沙龍第二十四期活動在中國食品發酵工業研究院舉行。參加本次活動的除了有來自中國食品發酵工業研究院、第二炮兵總醫院、清華大學、AB公司、軍事醫學科學院、北京科技大學的老朋友外，還有來自中國疾病預防控制中心、三○九醫院、總后藥檢所、地科院測試中心、中國水產科學研究院、北京化工研究院、上海儀真公司等的新朋友。
第二十四期質譜沙龍活動現場
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LC/MS/MS在生態地球化學研究中的應用
中國地質科學院國家地質實驗測試中心 王曉春 博士
首先，中國地質科學院國家地質實驗測試中心的王曉春博士做了題為《LC/MS/MS在生態地球化學研究中的應用》的報告。LC-MS/MS聯用技術操作簡單、準確度好、靈敏度高、測定時間短，可提供可靠的、精確的相對分子量和結構信息，因此是測定痕量有機物的理想方法。
LC/MS/MS對水及生物樣品中全氟有機化合物的分析方法
全氟有機物Perfluorinated compounds（PFCs）1951年由3M公司研制成功，已有50多年歷史，具有熱穩定性、化學穩定性、高表面活性及疏水疏油性。它常用于炊具、合成洗滌劑、滅火器、涂料和皮革，PFCs包括：全氟羧酸PFCA（如全氟辛酸PFOA）、全氟烷基磺酸鹽PFAS（如全氟辛烷磺酸PFOS）、全氟亞磺酸鹽、全氟磺酸胺、Telomer Alcohols等。它具有難降解性、生物蓄積性和沿食物鏈在生物體內富集的作用。比如，其中的全氟辛烷磺酸（PFOS）具有很強持久性，在任何水解、光解和生物降解環境條件下都不降解，并且會遠距離遷移。證據是：監測數據顯示北半球不同區域都有高濃度PFOS，特別是在遠離人為來源的北極生物圈中也有高濃度PFOS。PFCs的研究已成為國際上環境科學和毒理學研究的熱點。
已報道過的分析PFCs的方法可用單級四極桿液質、液質質（比如Q-TOF或三重四極桿）、氣質聯用GC/MS、液相熒光等。我國也出臺了PFOS的分析測試標準：GB/T 23243-2009《食品包裝材料中全氟辛烷磺酰基化合物(PFOS)的測定 高效液相色譜-串聯質譜法》，GB/T 24169-2009 《氟化工產品和消費品種全氟辛烷磺酰基化合物(PFOS)的測定 高效液相色譜-串聯質譜法》也即將實施。王博士他們使用的是三重四極桿液質聯用的負離子檢測模式。
在前處理方面，有以下幾種處理方法（王博士介紹其實驗主要采用第1、2種前處理方法）：
- 固相萃取法（水樣萃取、凈化）
- 離子配對——MTBE（甲基叔丁基醚）萃取——固相萃取（血清、肝臟、乳液等）
- ACN（乙睛）萃取（生物組織，全血）
- 甲醇和醋酸超聲提取（淤泥、生物組織）
- 堿性消化（生物組織）
- 酶消化（雞蛋）
基于以上背景，王博士利用LC/MS/MS研究了水及生物樣品中全氟有機化合物的分析方法。
王博士所在的研究小組研究了 “沈陽地區水環境中PFCS的時空分布特征及魚、家禽樣品中的含量水平”， 布設了40多個采樣點（包括水樣、土樣、家禽），在渾河和細河取水樣，采用高效液相色譜/電噴霧負電離源串聯質譜（1100-Quattro Ultima Pt，使用Betasil C18和JJ-50 2D色譜柱，醋酸胺和甲醇溶液流動相以及100%甲醇）進行研究，對于化合物PFPrS、PFEtS和PFPeA用JJ-50 2D色譜柱定量，其余均用Betasil C18柱定量。結果表明，對于全氟羧酸PFCAs（PFDA、PFNA、PFOA、PFHpA）分布而言，大部分結果表明，流經大城市（沈陽）后，PFCAs的含量升高，只有PFHpA沒有反映這種情況；而對于全氟烷基磺酸鹽PFASs（PFOS、PFBS、PFHxS）而言，所有化合物測定結果均表明，流經大城市（沈陽）后，PFASs的含量升高。另外，王博士課題組還比較了渾河與細河水樣品中PFASs和PFASs的濃度；比較了國內幾個城市自來水中PFOS與PFOA濃度，表明國內某大城市的PFOA值要高出其它城市大于一個數量級；比較了國內各省生物樣品(魚)中PFCs的含量，表明某省/地區魚體中的PFCs含量最高。
LC/MS/MS在大骨節病可以治病因子同步分析中的應用
王博士還向大家介紹了他正在進行的課題“LC/MS/MS在大骨節病可以治病因子同步分析中的應用”。
大骨節病病人癥狀
大骨節病（KBD）是一種原因不明的地方病，是一種以發育期兒童軟骨變形壞死為主要病理特征的地方病。目前關于KBD的致病原因有以下幾種假說，很多學說都有缺陷，王博士的課題組只只考慮真菌霉素中毒假說和生物地球化學說。從綜合分析各個假說可得出一個結論，即大骨節病不可能是單一致病因素引起的，所以綜合考慮不同致病因子間的協同作用可能是大骨節病病因研究的一個方向。這就需要建立一種能同時檢測T-2毒素和硒形態的方法，明確大骨節病兩種致病因子間的協同作用。
其中，T-2毒素的分析方法有GC-ECD、GC-MS/MS、HPLC-FD（熒光）、LC-MS、LC-MS/MS。課題組選用LC-MS/MS方法，樣品制備簡單，且具有高靈敏度。而硒形態分析也包括多種方法，選用LC-MS聯用技術，也是硒形態分析的發展方向之一。
課題組的主要工作目標是：在建立一種能對大骨節病可疑致病因子（鐮刀菌毒素與硒缺乏）進行同步分析的LC/MS/MS分析方法基礎上，詳細研究此兩種主要可疑致病因子間的協同作用以及對該病的實際貢獻程度。在研究中目前的思路包括用衍生試劑將無機硒轉化為有機硒，再建立對T-2毒素和有機硒同時檢測的LC-MS/MS（1200-API 4000）方法。
報告的最后，王博士還列舉了一些LC/MS/MS在生態地球化學領域的其它應用實例：
- 環境中的藥物：分析地表水和地下水中的藥物；
- 食品添加劑：比如三聚氰胺、孔雀石綠/隱性孔雀石綠；
- 元素形態分析中的應用：如砷、硒形態定量和定性分析等。
本網前沿Lab：國 家 地 質 實 驗 測 試 中 心
QTRAP型MS/MS儀的同時定性和定量特點
AB公司應用工程師 張克榮
AB公司的應用工程師張克榮工程師做了題為《QTRAP型MS/MS儀的同時定性和定量特點》的報告，介紹該的Q TRAP?儀器特有的功能，包括同時做定性定量以及在定性方面的優點。
QTRAP與三重四極桿不同之處在于Q3，它既可以作為一個三重四極桿的質量分析器又可以作為一個線性離子阱的質量分析器，這兩個功能的切換只需1ms。正因為這個Q3線性阱，離子可以進行存儲，QTRAP的MS/MS子離子掃描靈敏度（EPI模式）比三重四極桿高500倍，因此具有很強的定性功能。同時，還避免了傳統離子阱質譜的低質量截止效應（1/3效應）。另外，相比傳統離子阱，Qtrap還有從MS到MS/MS、MS3，信號強度下降少的優勢：以Trocade為例，傳統離子阱MS強度為3.54E7 cps，MS3為3.07E5 cps；而QTRAP的MS強度為5.1E6 cps，MS3為1.8E6 cps。
QTRAP的原理、功能及優勢
張工還介紹了QTRAP的IDA（信息相關采集Information Dependent Acquistion）模式，可以使發現和確證一次完成;反之若沒有這種IDA模式，發現和確證要進行兩次甚至多次的實驗。IDA的主要原理是，首先進行一次預掃描（預掃描可以是MRM、一級增強全掃描EMS、中性丟失掃描NL、增強多電荷掃描EMC等），一旦預掃描的強度值高于設定閾值，即自動觸發EPI掃描，在線采集MS/MS圖譜用于確證，比如可以到譜庫中檢索（AB公司QTRAP儀器中有2000余種化合物圖譜）。比如采用MRM預掃描觸發的IDA模式，即可一次實驗完成篩查、定量、確證。這個功能的好處是，在如食品安全等測定時，只用MRM很難消除內源物的干擾，用觸發的IDA模式進行在線MS/MS確證，可以大大減少內源物的干擾。
另外，用特有的MRM3模式，特異性更強，針對某些混合物，有時候能進一步減少內源物干擾、降低背景噪音，提高靈敏度。
接下來，張工介紹了幾個應用。
一、牛奶/奶粉中玉米赤霉醇的LC-MS/MS分析方法
在該例中，用QTRAP做MRM，分別為：α-玉米赤霉醇（MRM通道：m/z 321 > 277，出峰時間7.2 min），β-玉米赤霉醇（MRM通道：m/z 321 > 303，出峰時間7.7 min）。但空白樣品在4.4 min時對m/z 321 > 277有響應，在7.88 min時對m/z 321 > 303有響應。應用MRM觸發的IDA掃描來進行實驗，可以快速地對4.4 min、7.2 min、7.7 min、7.88 min出現的峰進行MS/MS掃描和譜庫檢索確認，最終發現4.4 min、7.88 min的MS/MS譜不匹配，因此是內源性干擾物；而7.2 min和7.7 min的分別確證為α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇。據介紹，很多進出口檢驗檢疫的用戶使用QTRAP的這種方法開展檢測，已大大降低了假陽性率。
二、藥物代謝物鑒定
張工先介紹了藥物代謝常見的一相和二相代謝物。以前，二相代謝物常采用母離子/中性丟失掃描來做，但對于一相代謝物鑒定比較困難。張工介紹說，QTRAP的特色就是具有多種復合的掃描模式，因此可以找到更多的代謝物；同時介紹了特色的pMRM方法和多個母離子/中性丟失掃描方法。pMRM是一種查找完整代謝物的方法，它可以根據母藥結構，自動組合MRM離子對，一次分析可作幾百個MRM“預測掃描”，并進行準確的MS/MS定性。而利用多個母離子/中性丟失掃描方法，可以對結構做特征的過濾，對代謝物反應檢測也是一種理想的方法。
在實例中，介紹了Verapamil（維拉帕米）代謝物的鑒定方法，共檢測到35個代謝物。其中，一次進樣用pMRM的預測掃描，發現了30個代謝物;通過母離子/中性丟失掃描又發現了5個新的代謝物。張工介紹說，這個實驗是和Thermo的一篇Orbitrap報告來比較的，在那篇報告里，鑒定了14個代謝物。
三、對活性化合物的鑒定和結構分析
張工舉例了對中藥肉蓯蓉（Cistanche deserticola Ma）的鑒定，它的主要活性成分是苯乙醇苷類化合物（Phenylethanoid glycosides, PeG），主要有兩個代表物，一個是麥角甾苷，一個是松果菊苷。根據苯乙醇苷類的主要質譜碎片，利用Qtrap特有功能設計試驗，通過EMS-ER-IDA-EPI，PREC-ER-IDA-EPI，NL-ER-IDA-EPI掃描模式，一次進樣同時得到樣品中所含化合物的分子離子和高分辨率的質譜圖，從而確證化合物的分子量；并得到其MS/MS圖譜，可對化合物進行結構分析。該實驗發現了32種苯乙醇苷類的化合物。
四、中毒藥物急救檢測
二炮總醫院的李鵬飛老師曾介紹過這種用QTRAP建立的多目標篩查流程，不再詳述。
中毒藥物急救的Qtrap LC-MS/MS篩查流程
最后，張工總結說：QTRAP技術將串聯四極桿與線性離子阱技術有機結合在一起，為臨床醫學、生物標志物、蛋白組學、代謝組學、藥物代謝物鑒定、環境分析、殘留藥物、毒物的篩查、食品安全分析等的研究提供了可靠的技術平臺。
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國外使用在線SPE-液相色譜-質譜聯用進行藥物代謝研究與臨床診斷的情況與最新進展
上海儀真公司 張建偉
上海儀真公司的張建偉老師向大家介紹了Symbiosis?在線SPE-液相色譜-質譜聯用系統。張老師講到，在線SPE與離線SPE不同之處在于，在線SPE不需要進行洗脫、氮吹以及重定容的步驟，只需閥切換過程即可直接進樣到液相色譜進行上樣，且為全量上樣，即將樣品完全上到分析柱中，而離線SPE只取十分之一或部分樣品上樣。
Symbiosis?在線SPE-液相色譜-質譜聯用系統主要由用液相色譜柱相連的Symbiosis XLC檢測器和質譜、熒光等檢測器組成，采用SPARKLINK軟件進行控制。如采用AB公司的質譜，可以直接用Analyst軟件反控Symbiosis?設備中的任何一個元件。張老師通過播放動畫，生動地向大家展示了XLC在線分析流程。整個過程連續，自動化程度高，大大節約了時間，SPE的時間幾乎可以忽略。
Symbiosis?的分析平臺由：樣品倉、自動進樣器、LC小泵、小柱更換單元以及高壓注射泵組成。在XLC/MS分析過程中，系統將樣品盤從樣品倉傳送到自動進樣器中，然后通過切換將樣品進樣到活化的SPE小柱中，經過固相萃取的淋洗和洗脫后，通過閥切換全量進樣在線進樣到LC分析柱上，然后進行液相分離和質譜分析。
目前，Symbiosis?在線SPE-液相色譜-質譜聯用系統在國外應用廣泛，90年代中期至今已發表應用文獻數百篇，如美國輝瑞研發中心發表的《全自動在線固相萃取-LC-MS/MS 方法的開發和應用：高通量直接分析血漿中的藥物化合物》、荷蘭Spark Holland發表的《在線SPE/LC/MS/MS 測定血漿中的維生素》等。
張老師最后列舉了幾個Symbiosis?應用實例：血漿中的25-羥基維生素D2/D3檢測、動物血漿中藥物檢測、人血漿中他林絡爾的藥物動力學研究、人尿液中堿性藥物的在線檢測，大家進一步了解了在線SPE的工作方式。
?????? 張老師講后，回答了大家感興趣的幾個問題，比如：Symbiosis使用的SPE小柱可反復使用，同一方法下可以用十幾次。活化溶劑跟離線的溶劑是一樣的。血漿最好先沉淀蛋白后再上樣，這樣可使SPE柱子使用時間更長。該系統自帶SPE的粒徑更小（Spark 萃取小柱粒徑：7-10 μm vs. 普通：40 μm），可以減少洗脫的溶劑量，從而提高靈敏度。Symbiosis的最大好處是進行高壓正相、高精度的固相萃取，可以精確、重現地取得目標化合物，把不需要的化合物去掉，并且是高通量的。
注：上海儀真公司是瑞士Spark公司的在線SPE-液相色譜-質譜聯用系統的代理商。
報告下載：國外使用在線SPE-液相色譜-質譜聯用進行藥物代謝研究與臨床診斷的情況與最新進展
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