液質聯用中的質譜——串聯質譜篇（下）
本文舉幾例常見的串聯質譜儀，篇幅較長分為上、中、下三篇。
串聯質譜掃描方式
串聯質譜的掃描方式包括以下幾種：
1、子離子掃描/產物離子掃描/碎片離子掃描（Product Ion Scan/Fragment Ion Scan）：
選擇某一質量的母離子進入碰撞室，與碰撞室內的碰撞氣體發生解離（CID或HCD），第二個質量分析器進行全掃描，得到的所有碎片離子都是由選定的母離子產生的子離子。如果是離子阱，則是分離出母離子，CID碰撞后，獲得所有的子離子譜。同時，離子阱還可獲得MS3、MS4等n級的子離子掃描譜。主要用于化合物結構分析。
2、母離子掃描/前體離子掃描（Parent Ion Scan/Precursor Ion Scan）：
第二個質量分析器被設定為固定檢測某一特定質荷比的子離子，而由第一個質量分析器掃描并檢測可經解離產生此特定子離子的所有母離子，可篩檢具有相同子結構的同系物，如鑒定多肽上是否含有特定的蛋白質翻譯后修飾（PTM），或應用于尋找藥物代謝物。
3、中性丟失掃描（Neutral Loss Scan）：
兩個質量分析器之間以相差一固定質量（即中性碎片質量）進行同步掃描，而僅有在CID過程中丟失此固定質量的離子方可被檢測到。因此中性丟失質譜圖中顯示能產生特定中性碎片的母離子，也就是含有目標官能團的不同分子譜圖。
4、選擇反應監測（SRM或多反應監測MRM）：
串聯質譜儀中兩個質量分析器均被用于檢測所選定的質量而進行掃描。此模式與單級質譜中的選擇離子監測（SIM）模式相似，差別在于SRM以第一個質量分析器選擇特定母離子，由第二個質量分析器監控特定的子離子，通常是信號強度最高或包含有特征結構新型的子離子。監測多個母離子和子離子，叫做MRM。MRM是定量分析時最常用的方法。
5、DDA和DIA（或SWATH）：
在子離子掃描MS/MS時，一般儀器會自動選擇執行，常用DDA（Data Dependent Acquisition）和DIA（Data Independent Acquisition）兩種數據采集模式。DDA數據依賴采集模式，是最原始最簡單的數據采集模式，在進行一級質譜分析后，根據設定的篩選條件（一般為離子強度的閾值Threshold）篩選母離子進行二級質譜分析，可獲得更多的碎片信息。該方法篩選目標離子采用的窗口較窄，在一定上可減少干擾離子的存在，但是也會導致一些離子峰強度較高的離子被當成目標離子進行二級質譜分析，從而出現采樣不準確、分析重復性較差的情況，因此，不太適合復雜樣本的分析。
DIA數據非依賴采集模式（SCIEX稱為SWATH），是DDA模式的延伸和發展，DIA主要通過高低碰撞能量進行一級質譜和碎片信息的交替采集，不需要對母離子進行篩選，利用若干個窗口對質譜進行全范圍掃描，對每個窗口中的所有離子進行快速、循環選擇和檢測，理論上可以獲得樣本中所有離子的全部碎片信息，提高了數據利用度，缺失值更少，分析重復性更高，更適合于大樣本和復雜樣本的分析檢測。
DDA和DIA的區別示意圖
6、PRM（平行反應監測，Parallel Reaction Monitoring）
SRM和PRM對比示意圖
是目前靶向蛋白質組學數據采集的主流方法，通過對特異性肽段或目標肽段（如發生翻譯后修飾的肽段）進行選擇性檢測，從而實現對目標蛋白質/修飾肽段的靶向相對或絕對定量。PRM是一種基于高分辨、高精度質譜的離子監視技術，能夠對目標蛋白質、目標肽段（如發生翻譯后修飾的肽段）進行選擇性檢測，從而實現對目標蛋白質/肽段的定量。首先利用四極桿質量分析器的選擇檢測能力，在一級質譜中選擇性地檢測目標肽段的母離子信息。隨后，在碰撞池中對母離子進行碎裂；最后利用高分辨、高質量精度分析器在二級質譜中檢測所選擇的母離子窗口內的所有碎片的信息。這樣即可對復雜樣本中的目標蛋白質/肽段進行準確地特異性分析。
上述幾種是主要的質譜掃描方式，各質譜公司根據各自質譜產品的特定，還會有特定的一些掃描模式，并給以不同的名稱。
離子活化/解離模式
獲得MS/MS或MSn需要進行離子活化/解離，大部分應用中都用CID，只是蛋白質組等組學應用中需要其它幾種模式，解離模式包括以下幾種：
1.碰撞誘導解離（Collison-Induced Dissociation，CID）
是最常見的產生碎片離子的方式，在碰撞室或離子阱/FTICR中發生。它包括兩個連續步驟：首先是快速移動的離子與目標分子（通常為惰性氣體）間的碰撞，離子達到振動激發態；第二個步驟是激發態離子進行自解離的過程。又分為高能CID和低能CID，前者常見于配置磁場、電場分析器或TOF分析器等的串聯質譜儀上，后者常用于三重四極桿、離子阱或FTICR串聯質譜儀上。
2.高能碰撞解離（High Energy Collision Dissociation, HCD）
HCD專指Orbitrap類儀器中離子在高能碰撞池或多級離子通道中的碎裂方式，相比于CID碎裂方式能獲得低m/z的碎片離子，產生的碎片相對更多，譜圖質量更高。
肽段CID/HCD的碎片裂解模式
3.電子捕獲解離（Electron Capture Dissociation，ECD）
ECD應用于帶正電荷的正離子解離上，正離子與陰極發射出的低能量電子束（常小于0.2 eV）間發生交互作用，多電荷的正離子可通過捕獲電子，降低其所帶正電荷數并產生自由基正電子進而誘導解離。由于活化過程非常快速，可觀察到直接的化學鍵斷裂， ECD僅僅適用于FTICR，因為ECD前離子需位于高密度的熱電子環境中。
ECD主要產生由 N—C α鍵的斷裂而形成的 c 和 z 類型離子；由于骨架鍵的斷裂發生在振動能量重新分布之前，ECD可以很好地保留非共價鍵以及弱的翻譯后修飾鍵信息；同時ECD的斷裂位點只取決于電子捕獲的位點而不考慮分子鍵能的高低，可以產生的碎片離子更加豐富，可與CID/HCD碎裂模式形成互補。
4.電子轉移解離（Electron Transfer Dissociation, ETD）和電子活化解離(Electron Activated Dissociation, EAD ）
ETD、EAD的碎裂行為和ECD類似，都是主要生成c、z離子。其中ETD模式在離子阱中將一個電子從引入的陰離子基團轉移到肽陽離子上引起肽段碎裂，因此稱之為電子轉移解離；帶負電的蒽離子（Anthracene Anion）與偶氮苯離子（Azobenzene Anion）最常被用于ETD。
相比于傳統的CID/HCD解離，ECD/ETD/EAD可以降低蛋白酶解的依賴性，能夠很好地裂解帶有更高電荷的大片段肽段和完整蛋白，得到幾乎完全斷裂的肽段，也能獲得豐富的c、z序列離子，并且保留蛋白質或肽段上帶有的修飾基團，如磷酸化修飾、N-和O-糖基化修飾、磺化修飾等，對蛋白質翻譯后修飾和Top-down蛋白質組學研究起到了有利的推動作用。
ECD/ETD/EAD的碎片裂解模式
然而該種模式解離帶有高電荷大片段肽段和完整蛋白時，得到的碎裂肽段帶電荷一般很高，譜圖復雜難以解析，在ETD反應體系中加入能與高電荷肽段發生質子轉移電荷減少反應(Proton Transfer Charge Reduction，PTCR) 的陰離子，將高電荷的解離產物轉化為較低電荷態，簡化譜圖有助于譜圖解析，PTCR技術也已用在成熟的商品化質譜儀中，如賽默飛三合一儀器——Orbitrap Eclipse和Orbitrap Ascend，這兩款儀器用于質子轉移的陰離子為全氟 (十四氫菲)離子。
接下來請見下篇：液質聯用中的質譜：檢測器
目錄：
前言：液質聯用（LC-MS）簡述
Chapter1、液質聯用中的液相色譜
Chapter2、液質聯用中的質譜
2.1離子源
2.2離子傳輸
2.3 質量分析器
2.4串聯質譜（Tandem Mass Spectrometry，MS/MS）
2.5 檢測器
2.6 真空系統
Chapter3、液質聯用中的數據采集和分析
