基因芯片技術與檢驗醫學
什么是基因芯片？基因芯片就是利用點樣技術、現代探針固相原位合成技術、照相平板印刷技術等微電子技術在有限的空間內，有序的集成一系列的可尋址識別的基因片段，以用于高通量、高速度、低成本的一種分子生物學工具。按照芯片的制作原理，基因芯片可以分為很多類，但目前真正成熟的，得以廣泛應用的仍只有使用點樣或原位合成技術的微陣列（Microarray）。
1?? 基因芯片的發展
1994年美國能源部防御研究計劃署、俄羅斯科學院和俄羅斯人類基因組計劃投資1000萬
美元開發出了第一塊基因芯片，用于地中海貧血100多個突變基因的篩查。之后，基因芯片無論在研究還是應用上都得以飛速的發展。目前，世界上包括Motorola、Packard等國際知名的大公司在內有2000多家公司從事基因芯片的研究和開發。近年來在技術上有突破性進展，ZL審請量呈直線上升趨勢，以mirroarray作為關鍵詞進入美國國家ZL和商標辦公室（The
US Patent and Trademark
Office）數據庫查詢，在1990年至1999年間，總共查出58個ZL，其中47個ZL是1998年到1999年批準的，1997年1個，1996年4個，1995年2個，1994年3個，1992年1個。而Affymetrix公司以其ZL光導原位合成技術，而領先于芯片分析領域。在應用上也是如此，截止2001年2月底，用“Microarray”在Medline中檢索到的文章多達438篇，而在早期統計的結果中，1995年3篇，1996年4篇，1997年2篇，1998年18篇，1999年1~6月有34篇。在國際三大權威科學雜志上的論文也是如此：
國際三大權威雜志近年來使用Microarray的論文數
2?? 基因芯片技術的方法學
2．1? 實驗原理? 基因芯片的生物學原理并不復雜，就是根據遺傳學中心法則，利用基因互補配對原則，在同一載體上同時進行多基因檢測。簡單的說就是高密度的班點雜交技術。但正因為其高密度，導致了一個量變到質變的過程，成為炙手可熱的生物實驗技術。
2．2? 實驗流程?
基因芯片根據種類和檢測目的不同具體實驗流程有差異，但主要流程都差不多，現以最常見的cDNA微陣列表達譜芯片最常見實驗流程為例做個簡單說明。表達譜芯片是檢測生物體在生命活動、病理狀態、用藥反應等情況下基因表達變化用的。我們知道，基因包含的遺傳信息是需要通過基因的翻譯和轉錄來體現的。因此，可以認為，只要在細胞或細胞中存在某基因相應的mRNA那么該基因在表達，反之，則沒表達。同時，mRNA的多少一定程度上反應了基因表達的強度。因此，表達譜芯片以檢測mRNA來檢測基因表達。但因mRNA很容易降解，因此多用其逆轉錄cDNA來實驗。同時，因為分子生物學技術在定量上的缺陷，目前基因芯片還僅僅用于比較定性。在方法學上多用內標參照。具體流程如下：
2．2．1? 將樣本和對照細胞或組織抽提出總RNA。
2．2．2? 將總RNA純化，提取mRNA。
2．2．3? 利用逆轉錄酶將mRNA逆轉錄為相應的cDNA。
2．2．4? 將對照參比的cDNA用CY3標記，樣本的cDNA用CY5標記，并將其等量混合制成混合探針。
2．2．5? 用混合探針與芯片雜交。
2．2．6? 洗脫，晾干。
2．2．7? 用激光共聚集掃描儀掃描結果分別對CY3和CY5掃描，用圖象處理軟件處理結果并做差減分析。（注：CY3及CY5是常用的熒光標記物，其特點是結構相似，不會影響雜交效率，并且激發波長不同，可以做雙波長測定。）
2．3? 結果分析?
基因芯片是建立在大量的實驗基礎上的。因此，基因芯片的結果分析有別于任何傳統實驗室技術。基因芯片的結果分析更多使用的統計學數學模型和分析技術。目前有一門新興的學科——生物信息學就來源于芯片。用于結果分析的方法很多，分組加權評估和分層聚類是較為常用兩種。
分層聚類是科研中應用最多的一種方法。主要適宜于大批量未知性質的數據研究。舉個例：Nature
2000年發表了一篇關于研究彌散性大B細胞淋巴瘤的文章，這篇文章利用基因芯片和分層聚類，發現彌散性大B細胞淋巴瘤的新亞型，并找到了分子印章，提供了分型的標準。通過聚類，我們可以發現同為彌散性大B細胞淋巴瘤卻明顯的分成了兩類，提示該病可能有亞型，再查病史，果然，兩者的死亡率相差點10個百分點以上。那么兩者倒底是哪些不同造成的呢？也就是說分型的依據是什么呢？現在我們再對基因聚類，這樣很容易就找出了兩類不同的基因表達，這就可以做為臨床分型的依據。將這些基因做成芯片就可以在臨床上使用了。分組加權評估多在臨床中使用，類似細菌鑒定儀原理。
2．4?? 質量控制?
作為成熟的實驗技術，特別是要在臨床中應用的實驗技術，不考慮質量控制是不行的。對于芯片因其可以同時做很多實驗，因此它可以將一個質控體系做于每張芯片上，真正做到了每個質控和絕對相同條件和操作，這種完美性的質量控制是傳統實驗質控體系無法比擬的。
一般在一張芯片上都被分為了很多個區，每個都設有內參比、陰性對照、陽性對照。常用做內參比和陽性對照是管家基因，管家基因的作用有以下兩點：
2．4．1? 用于定位? 因為芯片的高密度，因此要有至少4個角的高亮度定位，以便軟件分析。
2．4．2? 用于內參標準化驗室? 常用于檢測親源性很遠的基因做陰性對照，以發現是否存在污染。如測動物基因，用植物作陰性對照，反之亦然，測植物就用動物的。
2.5? 關于芯片結果的標準化?
由于芯片制作是納升級的，因此，制作的錯誤可能對結果有影響。在現階段都是用做片內比較分析，為了減小片間誤差增強實驗結果的片間可比性，因此對于實驗結果都要進行標準化。對于結果的標準化一般是使用管家基因，由于管家基因是生命活動必需的基因，表達相對穩定，差異小，所以根據各芯片的管家基因可以得出標準化系數進行標準化較正。
另外，現在有一種新的觀點，認為對于大樣本實驗結果而言，其符合正態分析，且均值穩定（相似于動態質控），使用InR=ΣinRi）/n（R為校正數，Ri為各基因的ratio值）校正。
2.6? 基因芯片與檢驗醫學?
基因芯片與檢驗醫學的關系是密切的。首先，它為臨床檢驗工作提供了一種全新的技術，使一些臨床檢驗工作中難解決的問題成為可能。我們知道，實驗室診斷在單一因素疾病診斷中具有決定性的意義，但由于人體和疾病的復雜性，單一指標在臨床工作的作用是有限的，這是往往需要多指標組合，而芯片技術正好提供了解決的思路。另外，有的實驗室難題在高通量的檢測中可以得以解決，如呼吸道、消化道致病菌檢測，結核的培養困難，耐藥很難檢測（可以測耐藥基因）等等。比如：在國外現有白血病診斷用芯片、高血壓診斷用芯片等等。國內也有人在研究致病
菌分析用芯片。其次，基因芯片特別是lab on chip
的研究會導致微加工技術的突破性進展，會造成臨床檢驗工作的高自動化，微量化，使床旁檢驗成為可能，并且完全能進入家庭，對檢驗工作的影響是翻天覆地的。
另外，基因芯片是高通量的群體指標分析，無論從方法上還是臨床醫學上都是一種全新的思維。人體和疾病是復雜的，傳統單一指標的診斷方式對臨床工作的幫助是有限的，因此，檢驗醫學在醫學中的重要性雖然在加強，但是檢驗醫學在實際工作中的作用卻深受限制。芯片可能會帶來革命性進展。
雖然目前世界上還沒有一款芯片受到FDA批準，但已有不少在臨床上使用，如：高血壓病因診斷芯片、急淋急非淋鑒別診斷芯片、地中貧血突變點篩查芯片等等。現在以一款呼吸道感染菌檢測芯片為例介紹一下基因芯片在檢驗醫學中的應用。
2．6．1? 設計芯片? 將呼吸道的致病菌特征基因片段全部點制在芯片上。
2．6．2? 首先裂解出細菌的DNA? 用內切酶將其切成大片段，然后用連接酶接上一個共同的引物，再用一對或兩對引物的作用下就可以擴增全部的細菌。
2．6．3? 將擴增產物與芯片雜交檢測即可。
3? 目前基因芯片在醫學臨床應用中的瓶頸
基因芯片短期內難以在臨床上廣泛應用的原因有幾點：
3．1? 目前我們對人體基因功能還知之甚少，基因芯片的優勢難以得到發揮，目前的基因芯片只能用于一些分子機理相對清楚的疾病診治，遺憾的是這部分疾病目前還很少。同是對于基因芯片的用藥指導（也就是個性化用藥）需要一個龐大的耐藥基因數據庫，可惜目前還沒有。
3．2?? 對于基因芯片的臨床應用在技術上還有較多的難題需加以解決?
這方面主要是：（1）增加信號檢測的靈敏度，芯片技術雖然是使用微量樣本，但因為是使用DNA或RNA，因此要求樣本量要大，用于臨床必須和PCR結合，但芯片是高通量的對于多重PCR有一點難度，當然目前也有解決的辦法，不過操作很煩瑣，成本也較高。（2）樣品處理和實驗操作的簡單化。分子生物學技術是比較繁瑣的，如果不能簡單化、自動化、在臨床上使用有相當的困難。不過高度集成化樣品制備、基因擴增、核酸標記及檢測儀器的研制和開發會解決這一問題。（3）作為一項全新的實驗室技術，質控體系有待建立和完善。（4）價格，目前基因芯片的價格太高，不能為臨床所接受，但隨著產業化進程價格會飛速下降，計算機芯片就是例證。
4?? 基因芯片的應用
4．1? 臨床疾病診斷?
基因芯片在感染性疾病、遺傳性疾病和腫瘤等疾病的臨床診斷方面具有獨特的優勢。與傳統檢測方法相比，它可以在一張芯片處同時對多個病人進行多種疾病的檢測；無需機體免疫應答反應，能及早診斷，待測樣品用量小；能檢測病原微生物的耐藥性，病原微生物的亞型；極高的靈敏度和可靠性；檢測成本低，自動化程度高，利于大規模推廣應用。
4.2? 藥物篩選和新藥開發?
芯片技術具有高通量、大規模、平行性等特點可以進行新藥的篩選，尤其對我國傳統的中藥有效成分進行篩選。目前，國外幾乎所有的主要制藥公司都不同程度地采用了基因芯片技術來尋找藥物靶標，查檢藥物的毒性或副作用，用芯片作大規模的篩選研究可以省略大量的動物試驗，縮短藥物篩選所用時間，在基因組藥學（pharmacogenomics）領域帶動新藥的研究和開發。
4.3? 基因功能研究?
在基因組學和后基因組學研究中，基因芯片也起到重要的作用。應用基因芯片可以開展DNA測序、基因表達檢測、基因突變性、基因功能研究、尋找新基因、單核苷酸多態性（SNP）測定等研究。與傳統的Northern
blot雜交或點雜交方法相比，基因芯片技術具有大規模平行處理的能力。
4.4? 環境保護? 在環境保護上，一方面可以快速檢測污染微生物或有機化合物對環境、人體、動物的污染和危害，同時也能夠通過大規模的篩選尋找保護基因，防治危害的基因工程藥品、或能夠治理污染源的基因產品。
4.5? 農業和蓄牧業? 利用基因芯片技術，對有條件反射
經濟價值的農作物和水果等的基因組進行大規模高通量的研究，篩選農作物的基因突變，并尋找高產量、抗病蟲、抗干旱、抗冷凍的相關基因，以開發高技術含量、高附加值的新產品。也可利用基因芯片技術篩選、開發高效低毒的生物農藥。
4.6? 軍事和司法?
美國部分公司得到政府的資助開發生物戰病原體檢測系統。在司法領域，國外的公司正在開始便攜式DNA芯片檢測裝置，它可以直接在犯罪
現場對可能是疑犯留下來的頭發、唾液、精液等進行分析，并立刻與DNA罪
犯指紋庫系統存儲的DNA“指紋”進行比較，以盡快、準確的破案。我國上海的司法部司法鑒定科學技術研究所第一個“罪犯DNA數據庫”在1999年9月7通過了專家鑒定，利用DNA破案將成為一種重要的破案手段。另外，基因芯片還可作為親子鑒定等方面的工作。
5?? 基因芯片的發展前景
在芯片的功能集成方面，目前美國的Nanogen公司、Affymetrix公司、賓西法尼亞大學醫學院和密歇根大學的科學家通過利用在芯片制作的加熱器、閥門、泵、微量分析器、電化學檢測器或光電子學檢測器等，將樣品制備、化學反應和檢測三部分作了部分集成。1998年6月，Nanogen公科學家首次報道了用芯片實驗室所實現的從樣品制備到反應結果顯示的全部分析過程。這個實驗室的成功是生物芯片研究領域的一大突破，它向人們展示了用生物芯片制作縮微實驗室的可能。
