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土壤微生物的分離、純化及初步鑒定

2019.4.23

實驗概要

分離、純化及初步鑒定土壤中的拮抗植物病原菌的放線菌。

實驗原理

土壤是微生物的“天然培養基”，也是最豐富的菌種資源庫，我們可以從中分離出眾多放線菌，尤其是可以從耕作土壤中篩選出拮抗植物病原菌的放線菌。
以耕作有武運粳和蘇滬香粳的土壤為樣品，應用稀釋涂布平板法分離各種微生物。菌落計數后，通過菌落形態觀察并挑取放線菌進行劃線分離純化，多次重復后得到單菌落。在進行放線菌形態等初步鑒定后，將純化的菌株接入斜面傳代保藏。最后，分離純化的放線菌，初步鑒定其拮抗性。
拮抗植物病原菌的放線菌的分離純化在農業增產、作物種植等方面都有著重要的意義。

主要試劑

1. 培養基：
高氏1號培養基、馬鈴薯葡萄糖培養基、牛肉膏蛋白胨培養基、葡萄糖蛋白胨水培養基
2. 其他試劑：?
銀染液A液 B液（細菌鞭毛染色）?40%KOH ? 5%α-萘酚（V.P.實驗）

主要設備

培養皿
試管
錐型瓶
接種環
移液管
震蕩器
電爐
載玻片
超凈工作臺
恒溫培養箱
高壓蒸汽滅菌鍋
顯微鏡等

實驗材料

土樣：
蘇滬香粳1，2組

楊稻6號 93113，4組

武運粳5，6組

實驗步驟

1. 稀釋涂布平板法(Spread Plate Method)

稀釋涂布平板法是一種將菌體按比例制備成若干個稀釋度，再分別經涂棒涂布培養而進行微生物分離純化的方法。

?? (1) 倒平板；???

? ?(2) 制備土壤稀釋溶液連續不斷稀釋，得到不同稀釋度的土壤溶液；

?? (3) 涂布分別吸取三種稀釋度菌液，均勻涂于培養基表面；

?? (4) 培養；?

?? (5) 劃線分離，直到獲得純培養。

2.?平板菌落計數法

平板菌落計數法是根據微生物在固體培養基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的現象進行的，也就是說一個菌落即代表一個單細胞。計數時，先將待測樣品作一系列稀釋，再取一定量的稀釋菌液接種到培養皿中，使其均勻分布于平皿中的培養基內，經培養后，由單個細胞生長繁殖形成菌落，統計菌落數目，即可換算出樣品中的含菌數。

這種計數法的優點是能測出樣品中的活菌數。此法常用于某些成品檢定（如殺蟲菌劑），生物制品檢定以及食品、水源的污染程度的檢定等。但平板菌落計數法的手續較繁，而且測定值常受各種因素的影響。

對每個平板上的菌落計數，計算每克或每毫升土壤樣品中含有細菌、放線菌的數量。公式如下：
菌體數量cfu/g（mL）土樣== 同一稀釋度重復的菌落平均數×稀釋倍數

3.?平板劃線分離法（Streak Plate Method）

平板劃線分離培養法對混有多種菌的平皿，用接種環以無菌操作沾取少許待分離的材料,在無板表面進行平行劃線和培養，使原來混雜在一起的菌種沿劃線在瓊脂平板表面分離，得到分散的單個菌落，以獲得純種。

? ?(1) 倒平板；?

? ?(2) 劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環，挑取上述的土壤懸液一環在平板上劃線，從而將樣品在平板上進行稀釋，形成單個菌落；

?? (3) 挑菌落同稀釋涂布平板法，一直到分離的微生物認為純化為止。

?

4.?插片顯微觀察法（放線菌）

插片培養法是實驗室觀察放線菌形態的一種基本方法，其步驟是：挑取青銅小單孢菌（Micromonospora chalcea）的少量孢子絲，將菌絲塊接種于高氏一號培養基的中間，然后，用小鑷子夾起一塊無菌的蓋玻片，以45度角的角度斜插入培養基中，不要插入培養基太深，讓菌絲爬上蓋玻片；于37℃下培養3～5天后，再用小鑷子將蓋玻片取出，顯微鏡下觀察基內菌絲、氣生菌絲和孢子絲的形狀。

5.?斜面傳代保藏法

斜面傳代保藏法是指將菌種（細菌和酵母菌宜采用對數生長期細胞，放線菌和絲狀真菌宜采用成熟的孢子）接種在適宜的固體斜面培養基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。

保藏時間依微生物的種類而有不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細菌保存2-4個月，移種1次。酵母菌2個月，移種1次。細菌最好每月移種1次。
此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法，優點是操作簡單，使用方便，不需特殊設備，能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點是容易變異，因為培養基的物理、化學特性不是嚴格恒定的，屢次傳代會使微生物的代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機會亦較多。

6.?放線菌形態觀察

?? (1) 放線菌菌落觀察

放線菌的菌落質地致密，表面呈緊密的絨狀，或堅實、干燥而多皺。由于基內菌絲長在培養基內，所以菌落與培養基結合較緊，不容易被挑起，或者被挑起后不容易破碎。當孢子絲形成大量孢子布滿菌落表面時，使菌落呈絮狀、粉末狀或顆粒狀，而與細菌菌落判然有別。此外，如用放大鏡仔細觀察，可以看見菌落周圍有放射狀菌絲。?

　(2) 放線菌主要通過形成無性孢子的方式進行繁殖。其孢子絲成熟時，分化形成許多孢子，稱為分生孢子。分生孢子常具色素，呈白、灰、黃、橙黃、紅、藍、綠等顏色。

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