基因的PCR擴增實驗原理、實驗材料和操作步驟
實驗原理
單鏈DNA在互補寡聚核苷酸片段的引導下，可以利用DNA聚合酶按5’→3’方向復制出互補DNA。這時單鏈DNA稱為模板DNA，寡聚核苷酸片段稱為引物（Primer），合成的互補DNA稱為產物DNA。雙鏈DNA分子經高溫變性后成為兩條單鏈DNA，它們都可作為單鏈模板DNA，在相應的引物引導下，用DNA聚合酶復制出產物DNA。PCR反應應用以上的基本過程，分別在待復制的已知序列DNA分子兩端各設計一條引物，其中在DNA5’端的引物（Pl）對應于上鏈DNA單鏈的序列，3’端的引物（P2）對應于下鏈DNA單鏈的序列，Pl和P2按5’→3’方向相向配置。在含有引物、DNA合成底物dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸等摩爾數混合物）的緩沖液中，通過高溫變性，使雙鏈DNA變成單鏈DNA模板，降低溫度復性，使引物與模板DNA配對，利用DNA聚合酶便可合成產物DNA。引物和dNTPs過量，則在同一反應體系中可重復高溫變性、低溫復性和DNA合成這一循環，使產物DNA重復合成，并且在重復過程中，前一循環的產物DNA可作為后一循環的模板DNA參與DNA的合成，使產物DNA的量按2n方式擴增，所以這一反應稱為聚合酶鏈式擴增反應。理論上如果引物及dNTP的量能夠滿足，則這一過程可無限重復，使模板DNA無限擴增。PCR反應使幾個DNA模板分子通過數小時擴增后增加到百萬倍以上，因此能用微量樣品獲取目的基因，同時也完成了基因在體外的克隆，成為分子生物學及基因工程中極為有用的研究手段。另外在醫學研究和醫療診斷中亦體現出極大的應用價值。
常規PCR反應用于已知DNA序列的擴增，反應循環數為25～35，變性溫度為94℃，復性溫度為37℃～55℃，合成延伸溫度為72℃，DNA聚合酶為Taq酶（可耐受 95℃左右的高溫而不失活），DNA擴增倍數為106～109。
引物的設計在PCR反應中極為重要。要保證PCR反應能準確、特異、有效地對模板DNA進行擴增，通常引物設計要遵守以下幾條原則：①引物長度：15~25個核苷酸；②CG含量為40%~60%；③Tm值高于
55℃[Tm=4(C+G)+2(A+T)計算]；④引物與模板非特異性配對位點的堿基配對率小于70%；⑤兩條引物間配對堿基數小于5個；⑥引物自身配對（特別是在引物的3’端）形成的莖環結構，莖的堿基對數不大于3。由于影響引物的設計的因素比較多，所以常常利用計算機來輔助設計。
實驗材料和試劑
（一）試劑
1．4×dNTP： lmmol/L dATP
lmmol/L dCTP
lmmol/L dGTP
lmmol/L dTTP
2．Taq酶：5U/ml
3．模板DNA：0.1mg/ml
4．引物：Pl： 5'-TTCCATATGCCTACTTCAAGTTCT-3'
P2：5'-ACCTAAGCTTGCTTCAAGTTAGTGT-3'
引物溶液濃度：50nmoI/L
（二）器皿
0.5ml薄壁Eppendorf管
（三）儀器
PCR自動擴增儀 離心機
微量注射器 微量移液器
電泳儀 水平電泳槽
透射紫外觀察儀
實驗步驟
（一）準備PCR反應溶液
1．取薄壁 0.5mlEppendorf管一只，用微量注射器按以下順序分別加入各試劑。
10×緩沖液10ml
4×dNTP10ml
引物Pl1ml
引物P21ml
模板DNA1ml
Taq酶1ml
加無菌雙蒸餾水至100ml
2．用手指輕彈Eppendorf管底部，使溶液混勻。在臺式離心機中離心2秒以集中溶液于管底。
3．加石蠟油50ml封住溶液表面。
（二）PCR擴增反應
將加好樣品的Eppendorf管插在PCR自動擴增儀樣品板上，95℃10分鐘，使模板充分變性。然后按以下步驟在PCR自動擴增儀中進行反應，25～35個循環。
93℃30秒
55℃45 秒
72℃45秒
反應完畢，將樣品取出置于冰浴中待用。
（三）結果檢測
本實驗PCR擴增的產物DNA片段長度為609bp，適合于1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。
【提示】
（一）引物設計
由于PCR反應在實用中，模板DNA往往來源于組織和細胞，所以樣品的DNA背景十分復雜（如一個人的細胞含有30億對堿基的DNA）。設計引物時不能通過檢索這些DNA的背景資料來得到特異性的引物，也就是說設計的引物不能完全排除與背景DNA還存在有大部份配對或完全配對的位點，盡量使設計的引物符合設計的一般原則，將可通過控制PCR反應條件來減少非特異性配對位點對反應的干擾。
（二）非特異擴增產物的出現
當擴增的DNA產物不止一種時，通常與以下幾種情況有關：①背景DNA有與引物同源性高的其它位點。可通過在兩個引物的內側序列上再使用另外一對或二條引物對擴增的產物DNA再做PCP擴增；②退火溫度太低。引物與模板的配對是一個動態過程，分子的熱運動使引物與模板結合與解離而達到最佳配對位點上。退火溫度太低，造成引物與模板的非特異性位點部分配對而不解離下來，這種不正確的配對，進入PCR反應過程就可擴增出非特異的產物DNA。提高反應的退火溫度（有時此Tm值高出幾度）將可改善結果；③過量的酶、引物和dNTP可使PCR反應造成混亂，強行擴增出非特異產物DNA，適當降低這些試劑的量有助于問題的解決。
（三）PCR反應擴增不出DNA條帶
在實驗中偶而會出現這類情況，一般有以下幾種原因：①引物的3’端與5’端書寫錯誤，造成引物合成的錯誤。此時應重新合成引物；②引物溶液反復凍融或污染了DNA酶類，造成引物降解。換一份引物可解決該類間題；③模板DNA制備時模板己降解。這時應盡量找一些指示指標來檢測模板質量；④Taq酶有失活或有雜酶污染。重新換一份酶；⑤緩沖液條件不當。各類PCR反應要求的條件并不完全一致，其中Mg2+離子的濃度對Taq的活性影響尤為明顯，Mg2+濃度直接影響到DNA擴增的特異性和擴增DNA的產率，在反應體系中，由于DNA模板、引物、四種dNTP的磷酸基團，以及引物、模板原液中的EDTA等螯合劑都要結合Mg2+,因此合適的Mg2+濃度至關重要。一般的情況下，過量的Mg2+會導致酶催化非特異性產物的擴增，而Mg2+濃度過低，又會影響
Taq酶的活性，使產物DNA量降低。為了選擇到最佳的反應條件，在實驗前，可設置在一定濃度的模板DNA、引物、dNTP和循環參數下，用不同濃度（如
0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、……5.0mmol/L）Mg2+進行預實驗。在確定大概濃度后，可在該濃度上以0.2mmol/L增減。
10×緩沖液中用100mmol/LTris-HCl是一種雙極性離子緩沖液，以維持合適的pH的緩沖能力，10×緩沖液中的100mmol
/LKCl是有利于引物的退火，但是過高的KCl將抑制酶的活性。緩沖液中的明膠、TritonX-l00是為了穩定酶不變性失活，有的反應中加入
100mg/ml的小牛血清白蛋白或0.05%Tween20，以及5mmol/LDTT，都是酶的保護劑。50%甘油是為使酶保存于-20℃時，不因結冰而失活。這些酶的保護劑如果濃度過高，特別是質量欠佳時，往往都抑制酶在反應中的活性，在使用時應特別注意。在反應體系中如果加入10%的
DMSO（二甲亞砜）可以減少二級結構的形成，增加反應的特異性，但它對酶的活性也有少許抑制作用。
（四）反應體系加樣順序
反應體系一般為50～100微升體積，體系中加樣順序為dH2O補充體積，10×緩沖液（體積1/10），4種dNTP（各
20～200mmol/L），兩條引物（各0.1～0.5mmol/L），模板DNA要根據其分子量而定，一般在102～105拷貝數；Taq酶常要稀釋為2.5單位/100ml。為了防止高溫反應時液體的揮發，常加入石蠟油封閉體系。
（五）脫氧核苷三磷酸濃度
脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）在反應中的濃度也非常重要，常用的濃度一般為20～200mmoI/L，而且四種dNTP的終濃度相等。高濃度會抑制TaqDNA聚合酶的活性，引起聚合酶催化錯配，而且由于反應中dNTP結合Mg2+的量較大，所以四種dNTP的量相應為Mg2+的濃度提供參考。
（六）溫度和循環參數
PCR擴增循環中的變性、退火、延伸的過程是反應體系在合適的條件下，通過不同的溫度變化來實現的。在PCR中控制溫度是關系到實驗成敗的重要環節。PCR的變性是實驗進行的基礎，如果加熱的溫度不能使靶基因模板和PCR產物的雙鏈完全變性解離，則會造成PCR實驗的失敗。常用的變性溫度是90℃～94℃，為了提高變性效果而又不影響酶的活性，可在加酶前于97℃變性5分鐘左右，加酶后的循環變性中以93℃～94℃變性30秒；退火的溫度依賴于引物的長度、濃度及堿基組成如CG的含量，一般為
55℃30秒鐘，引物的退火溫度可根據Tm=4(G+C)+2(A+T)公式進行計算；PCR的延伸溫度在70℃～75℃之間，常用72℃，延伸
1分鐘，延伸的時間要根據擴增DNA的長度而定；PCR循環的次數為20～35次，循環次數取決于模板DNA的濃度。循環的次數越多，反應非特異產物也越多，因此循環次數不宜過多。
