PCR擴增DNA（PCR Amplify DNA）實驗原理、材料和操作步驟
【實驗原理】
聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）是一種體外
DNA擴增技術，1985年由Mullis等人創立。該技術能在幾小時的實驗操作中，將人為選定的一段DNA擴增幾百萬倍，具有靈敏度高、特異性強、操作簡便和應用廣泛等優點，目前已成為分子生物學及基因工程中極為有用的研究手段，另外在醫學研究和醫療診斷中亦體現出極大的應用價值。
PCR的工作原理類似于DNA的體內復制過程，是將待擴增的DNA片斷和與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經變性、退火及延伸三步反應的多次循環，使特定的DNA片斷在數量上呈指數增加。PCR擴增首先需要一對引物，根據待擴增區域兩側的已知序列合成兩個與模板DNA互補的寡核苷酸作為引物，引物序列將決定擴增片段的特異性和片段長度。反應體系由模板DNA、一對引物、dNTP、耐高溫的DNA聚合酶、酶反應緩沖體系及必須的離子等所組成。PCR反應循環的第一步為加熱變性，使雙鏈模板DNA變性為單鏈；第二步為復性，每個引物將與互補的DNA序列雜交；第三步為延伸，在耐高溫的DNA聚合酶作用下，以變性的單鏈DNA
為模板，從引物3ˊ端開始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA鏈。這樣經過一個周期的變性——復性——延伸等三步反應就可以產生倍增的DNA，假設PCR的效率為
100%,反復n周期后，理論上就能擴增2n倍。PCR反應一般30-40次循環，DNA片段可放大數百萬倍。
常規PCR反應用于已知DNA序列的擴增，變性溫度為95℃，復性溫度為37℃～55℃，延伸合成溫度為72℃，DNA聚合酶為Taq酶（可耐受95℃左右的高溫而不失活），反應循環數為30。
【實驗材料】
1.實驗器材
PCR擴增儀，臺式高速離心機，移液器，經高壓滅菌后的Eppendorf 管，電泳儀。
2.實驗試劑
（1）模板DNA（0.1μg/μl）：用牙簽挑取單菌落懸浮到50μl的裂解液中（裂解液
1%TritonX-100，20mmol/lTris-HClPH8.2,2mmol/lEDTA）,95℃溫浴10分鐘,10000rpm離心5分鐘,取2μl上清液用于總體積50μl的PCR反應。
（2）TaqDNA聚合酶（5U/μl），10×擴增緩沖液，dNTP（1mmol/L）：購買
（3）引物（100pmol/L）：設計并合成與目的DNA兩側互補的引物內。
【實驗操作】
1．準備PCR反應溶液
（1）按以下次序，將下列成分在0.5ml滅菌Eppendorf管內混合：
10×擴增緩沖液10μl
4×dNTPs(包括四種dNTP)8μl
引物 11μl
引物21μl
模板DNA1μl(10ng)
TaqDNA聚合酶1μl(2.5U)
加水至終體積100μl
（2）用手指輕彈Eppendorf管底部，使溶液混勻。在臺式離心機中離心2秒以集中溶液于管底。
（3）加石蠟油50μl封住溶液表面。
2．PCR擴增反應
將加好樣品的Eppendorf管置于PCR擴增儀內，95℃5分鐘，使模板DNA 完全變性。然后按95℃變性1分鐘，55℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，重復循環30次，循環結束后72℃延伸8分鐘。反應完畢，將樣品取出置-4℃待用。
【實驗結果】
取出樣品，進行瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺電泳，溴化乙錠(EB)染色，觀察DNA條帶。
【討論】
1．PCR結果若出現非特異性的擴增條帶，有必要進一步優化反應條件，包括改變退火溫度和時間，調整Mg2+濃度等。
2．PCR反應特異性強，引物濃度、TaqDNA聚合酶和dNTP的量不宜過多。
3．引物設計要合理。一般引物長度為18
個~30個核苷酸；引物間的G+C含量應為40%～60%，而且避免引物內部產生二級結構；引物3ˊ端不應該互補，避免在PCR反應過程中產生引物二聚體；避免引物3ˊ端出現3個連續的G或C；理想的情況下，成對引物的G、C含量應相似以便以相近的退火溫度與互補的模板鏈相結合，此外，引物5ˊ端序列對于后續操作也是十分有用的，例如，對PCR產物進行克隆時，可以考慮在引物5ˊ端引入限制性酶切位點。
